siRNA عكس إسكات الجينات القائم على التعدي في المختبر: إجراء لتوصيل الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل في الخلايا المستنبتة لتعطيل التعبير الجيني المستهدف

الملخص

المصدر: Jager ، J. et al. نموذج لزراعة الخلايا الشحمية لدراسة تأثير تعديل البروتين والحمض النووي الريبي الصغير على وظيفة الخلايا الشحمية. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف إجراء لإجراء تعداء عكسي ل siRNA إلى الخلايا الشحمية لتعديل التعبير عن البروتين المستهدف.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الألواح المطلية

مسبقا

1. في اليوم السابق أو قبل ساعات قليلة من التعدي ، قم بإعداد محلول من الكولاجين من النوع الأول عند 100 ميكروغرام / مل في 30٪ إيثانول من محلول مخزون عند 1 مجم / مل. أضف 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من طبق مكون من 12 بئرا و 125 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 24 بئرا ، وانشر المحلول على سطح البئر.
2. اترك الطبق بدون غطاء تحت غطاء المزرعة حتى يجف الكولاجين. يغسل مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS).
   ملاحظة: الألواح المطلية مسبقا متاحة للشراء.

< p class = "jove_title" >2. تحضير مزيج التعداء

< p class = "jove_content" style = "margin-lef....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا دوتشر 353043 2.5٪ تربسين (10x) جيبكو 15090-046 مخفف إلى 5x باستخدام D-PBS 2-بروبانول سيغما I9516 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين سيجما ألدريتش د5879 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 7030 الكولاجين من النوع الأول من جلد العجل سيجما ألدريتش [ك8919] [ك8919] ديكساميثازون سيجما ألدريتش د1756 د-بي بي إس جيبكو 14190144 وسط النسور المعدلة من Dulbecco (DMEM) جيبكو 41965062 4.5 جم / لتر D-الجلوكوز ؛ لام-الجلوتامين; لا بيروفات ايثانول سيغما 51976 miRIDIAN micro-RNA يحاكي هورايزون ديسكفري SIRNA للتحكم السلبي المسمى FAM إنفيتروجين AM4620 مصل العجل حديثي الولادة جيبكو 16010-159 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10270-106 البنسلين والستربتومايسين جيبكو 15140-122 SIRNA للتحكم السلبي المسمى FAM إنفيتروجين AM4620 ON-TARGETplus ماوس Plin1 siRNA SMARTpool هورايزون ديسكفري L-056623-01-0005 كاشف الجلسرين الحر سيجما ألدريتش F6428 صحن بتري 100 مم × 20 مم دوتشر 353003 كاشف النعداء (INTERFERin) بولي بلس 409-10 الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (Opti-MEM) جيبكو 31985-047 الأنسولين ، مؤتلف بشري جيبكو هاتف: 12585-014