siRNA عكس إسكات الجينات القائم على التعدي في المختبر: إجراء لتوصيل الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل في الخلايا المستنبتة لتعطيل التعبير الجيني المستهدف

الملخص

المصدر: Jager ، J. et al. نموذج لزراعة الخلايا الشحمية لدراسة تأثير تعديل البروتين والحمض النووي الريبي الصغير على وظيفة الخلايا الشحمية. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف إجراء لإجراء تعداء عكسي ل siRNA إلى الخلايا الشحمية لتعديل التعبير عن البروتين المستهدف.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الألواح المطلية

مسبقا

1. في اليوم السابق أو قبل ساعات قليلة من التعدي ، قم بإعداد محلول من الكولاجين من النوع الأول عند 100 ميكروغرام / مل في 30٪ إيثانول من محلول مخزون عند 1 مجم / مل. أضف 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من طبق مكون من 12 بئرا و 125 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 24 بئرا ، وانشر المحلول على سطح البئر.
2. اترك الطبق بدون غطاء تحت غطاء المزرعة حتى يجف الكولاجين. يغسل مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS).
   ملاحظة: الألواح المطلية مسبقا متاحة للشراء.

< p class = "jove_title" >2. تحضير مزيج التعداء

< p class = "jove_content" style = "margin-left: 0.25in ؛" >ملاحظة: يتراوح التركيز النهائي ل siRNA بين 1 و 100 نانومتر (1 إلى 100 pmol من siRNA لكل بئر من صفيحة 12 بئر). التركيز النهائي لتقليد miR هو 10 نانومتر (10 بمول / بئر). حدد أفضل تركيز لكل siRNA أو miR أو قليل النوكليوتيد الآخر قبل بدء التجربة لتجنب التأثيرات غير المستهدفة. إجراء تجارب التعدي في ثلاث نسخ لتسهيل التحليل الإحصائي للنتائج. قم بإعداد جميع الكواشف الزائدة لحساب الخسارة الطبيعية أثناء سحب العينات.

1. امزج عن طريق سحب العينات (الحجم / الحجم) siRNA (أو قليل النوكليوتيدات الأخرى) مع الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (الجدول 1). احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. أضف كاشف التعدي والوسط الأساسي الأدنى المحسن إلى siRNA ، والماصة للخلط (الجدول 1). احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خلال هذا الوقت ، انتقل إلى القسم 3). أضف مزيج التعداء إلى كل بئر من اللوحة المطلية بالكولاجين.

فئة < ص = "jove_title" >3. تحضير الخلايا الشحمية 3T3-L1

1. اغسل الخلايا في طبق بتري مقاس 100 مم مرتين باستخدام D-PBS. أضف 5 أضعاف التربسين إلى الخلايا (1 مل لكل طبق 100 مم) ، مع التأكد من تغطية كل السطح بالتربسين. انتظر لمدة 30 ثانية وقم بإزالة التربسين بعناية.
2. احتضن طبق بتري لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اضغط على الطبق مقاس 100 مم لفصل الخلايا.
3. أضف 10 مل من DMEM بدون بيروفات ، و 25 ملي مولار جلوكوز ، و 10٪ FCS ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين لتحييد التربسين. قم بسحب الوسط بعناية لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا وتجانس معلق الخلية.
4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد المالاسيز أو عداد الخلايا الآلي ، واضبط تركيز الخلايا على 6.25 × 10⁵ خلايا / مل من الوسط. بذرة 800 ميكرولتر من معلق الخلية / بئر صفيحة 12 بئرا (5 × 10⁵ خلايا) أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر صفيحة 24 بئرا (2.5 × 10⁵ خلايا) تحتوي على مزيج ><التعداد. ملاحظه: سيسمح طبق بتري واحد مقاس 100 مم من الخلايا الشحمية بإعداد طبق واحد من 12 بئرا أو طبق واحد من 24 بئرا. يحتوي الطبق مقاس 100 مم عادة على 6-7 × 10⁶ خلايا شحمية ، والتي تتوافق مع 5 × 10⁵ خلايا شحمية لكل بئر من صفيحة 12 بئرا.
5. احتضان الصفائح في حاضنة زراعة الخلايا (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية) ، ولا تزعج الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية بعناية ب DMEM الطازج بدون بيروفات ، و 25 ملي مولار جلوكوز ، و 10٪ FCS ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين.
   ملاحظة: من الممكن أيضا زرع الخلايا في ألواح 48 و 96 بئرا مطلية بالكولاجين ولكن اتخاذ المزيد من الاحتياطات عند استبدال الوسائط لتجنب انفصال الخلايا الشحمية.

لكل بئر (طبق 12 بئر) لكل بئر (طبق 24 بئر) قليل النوكليوتيدات 20 ميكرولتر 10 ميكرولتر (سي - الحمض النووي الريبي ، مير ...) تحسين الحد الأدنى من الوسط الأساسي 20 ميكرولتر 10 ميكرولتر كاشف التعداء 5.6 ميكرولتر 2.8 ميكرولتر تحسين الحد الأدنى من الوسط الأساسي 154.4 ميكرولتر 77.2 ميكرولتر الحجم الكلي لمزيج التعداء 200 ميكرولتر 100 ميكرولتر

الجدول 1: الكواشف النفقة المطلوبة لتنسيقات الألواح ذات 12 بئرا و 24 بئرا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا دوتشر 353043 2.5٪ تربسين (10x) جيبكو 15090-046 مخفف إلى 5x باستخدام D-PBS 2-بروبانول سيغما I9516 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين سيجما ألدريتش د5879 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 7030 الكولاجين من النوع الأول من جلد العجل سيجما ألدريتش [ك8919] [ك8919] ديكساميثازون سيجما ألدريتش د1756 د-بي بي إس جيبكو 14190144 وسط النسور المعدلة من Dulbecco (DMEM) جيبكو 41965062 4.5 جم / لتر D-الجلوكوز ؛ لام-الجلوتامين; لا بيروفات ايثانول سيغما 51976 miRIDIAN micro-RNA يحاكي هورايزون ديسكفري SIRNA للتحكم السلبي المسمى FAM إنفيتروجين AM4620 مصل العجل حديثي الولادة جيبكو 16010-159 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10270-106 البنسلين والستربتومايسين جيبكو 15140-122 SIRNA للتحكم السلبي المسمى FAM إنفيتروجين AM4620 ON-TARGETplus ماوس Plin1 siRNA SMARTpool هورايزون ديسكفري L-056623-01-0005 كاشف الجلسرين الحر سيجما ألدريتش F6428 صحن بتري 100 مم × 20 مم دوتشر 353003 كاشف النعداء (INTERFERin) بولي بلس 409-10 الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (Opti-MEM) جيبكو 31985-047 الأنسولين ، مؤتلف بشري جيبكو هاتف: 12585-014