$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تعداء بلازميد الاستجابة الذي يعبر عن الجين محل الاهتمام (GOI) في الخلايا الظهارية السنخية الأولية
- عزل الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني من رئتي الفئران.
- قم بزرع الخلايا بكثافة 1 × 106 خلايا / سم2 في أطباق بتري مقاس 100 مم مع الحد الأدنى الكامل من الوسط الأساسي (MEM كامل). MEM الكامل عبارة عن MEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 0.08 مجم / لتر توبراميسين و Septra (3 ميكروغرام / مل تريميثوبريم و 17 ميكروغرام / مل سلفاميثوكسازول) و 0.2٪ NaHCO3 و 0.01 M HEPES (الرقم الهيدروجيني = 7.3) و 2 ملي مولار من الجلوتامين. استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة مرطوبة.
- في اليوم التالي ، ضع 500 ميكرولتر من MEM الكامل بدون مضاد حيوي في كل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 12 بئرا وقم بتسخين الطبق مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الخطوة ، من المهم استخدام مصل الأبقار الجنيني الخالي من التتراسيكلين الملوث أو بمستوى منخفض جدا لا يتداخل مع التحفيز.
- قم بإعداد أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على البلازميد مع GOI المحفز (بلازميد GOI) والناقل التنظيمي (على سبيل المثال ، pTet-Off) عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من بلازميد GOI و 1 ميكروغرام من المتجه التنظيمي لكل بئر في RT. بالنسبة لتجارب التعبير المشترك مع البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBP) ، تتم إضافة 1 ميكروغرام من متجه تأسيسي (على سبيل المثال ، pcDNA3) يعبر عن RPB ذي الاهتمام إلى مزيج الحمض النووي (الشكل 4).
- شفط الوسط واشطف الخلايا برفق باستخدام PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
- أضف 5 مل من 0.05٪ تريبسين مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية واحتضان الخلايا حتى تنفصل الخلايا (2-4 دقائق). قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 10 مل من MEM الكامل بدون مضاد حيوي.
- اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل ، واغسل طبق بتري ب 4 مل من الوسط لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا المتبقية ، ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
- استنشق المادة الطافية برفق وتخلص منها وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS. عد وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
قم - بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أضف الخلايا من أنبوب 1.5 مل المحضر في الخطوة 2.4 بتركيز 400,000 خلية لكل بئر واخلطها برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
- ضع الأنبوب في جهاز التثقيب الكهربائي واملأه ب 3.5 مل من المخزن المؤقت الإلكتروليتي.
- أدخل طرف قطب كهربائي مطلي بالذهب في ماصة عن طريق الضغط على المكبس بالكامل. امزج محتويات الأنبوب سعة 1.5 مل برفق وشفط الخلايا بعناية باستخدام الماصة. احرص على منع فقاعات الهواء من دخول الحافة ، لأن ذلك سيؤدي إلى الانحناء الكهربائي أثناء التثقيب الكهربائي ويؤدي إلى انخفاض كفاءة التعداد.
- أدخل الماصة في محطة التثقيب الكهربائي حتى يصدر صوت طقطقة.
- حدد بروتوكول التثقيب الكهربائي المناسب للخلايا الظهارية السنخية ، المقابلة لجهد نبض يبلغ 1,450 فولت و 2 نبضة بعرض 20 مللي ثانية ، واضغط على ابدأ على شاشة اللمس.
- مباشرة بعد التعداد، قم بإزالة الماصة ونقل الخلايا إلى بئر مملوء مسبقا ب MEM كامل بدون مضاد حيوي تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوات 1.11-1.14 للعينات المتبقية.
- رج الطبق برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي على سطح البئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة مرطبة. بعد يومين ، استبدل الوسيط ب MEM كامل بالمضادات الحيوية.
- تأكد من نجاح التعدي من خلال مراقبة التعبير عن eGFP تحت المجهر الفلوري أو عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام ناقل تحكم (الشكل 1).
ملاحظه: هذه الخطوة اختيارية وتتطلب خطوة تعداء إضافية باستخدام بلازميد مختلف يعبر عن eGFP ، مثل pcDNA3-EGFP.
< p class = "jove_title" >
2. تحريض تثبيط النسخ للحكومة العراقية
ملاحظة: يمكن معالجة الخلايا مسبقا بالعلاجات المرغوبة قبل تحريض الدوكسيسيكلين لتقييم تأثيرها على استقرار mRNA (الشكل 3).
- تحضير محلول مخزون الدوكسيسيكلين بمقدار 1 مجم / مل في ماء منزوع الأيونات. قم بتخزين محلول المرق عند -20 درجة مئوية محميا من الضوء. يستخدم الدوكسيسيكلين ، وهو مشتق من التتراسيكلين ، بدلا من التتراسيكلين لأنه يتمتع بعمر نصف أطول (2x) من التتراسيكلين. علاوة على ذلك ، يلزم وجود تركيز أقل من الدوكسيسيكلين للتعطيل الكامل لمشغل tet.
ملاحظه: يمكن أن يؤثر الدوكسيسيكلين على تعبير الحمض النووي الريبي المرسال للحكومة العراقية الذاتية. للتحقق من ذلك ، يجب اختبار تأثير العلاج لمدة 24 ساعة بالدوكسيسيكلين على الخلايا السنخية لتأكيد عدم وجود أي تغييرات في تعبير GOI (الشكل 2).
- قم بإعداد محلول دوكسيسيكلين طازج 1 ميكروغرام / مل في MEM كامل بعد 72 ساعة من التعداء وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
- استبدل الوسط ب 1 مل من MEM الكامل الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين لكل بئر لمنع نسخ الحكومة العراقية.
- احتضان آبار متعددة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لفترات زمنية مختلفة من 15 دقيقة إلى 6 ساعات لتقييم عمر النصف للرنا المرسال للحكومة العراقية.
- في نهاية العلاج ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج وقم بتحللها باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفينول وكلوروفورم المتوفرة تجاريا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر وهز اللوحة لتجانس الخلايا.
- اعزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حدد عائد الحمض النووي الريبي ونقاءه عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 230 و 260 و 280 نانومتر. تعتبر عينات الحمض النووي الريبي بنسب 260: 230 و 260: 280 1.8 و 2.0 ، على التوالي ، نقية.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
