التحول الجيني القائم على نواقل الكروموسوم الاصطناعية البكتيرية الثنائية في نباتات نبات الأرابيدوبس: تقنية لتوليد نباتات معدلة وراثيا بإدخال نسخة واحدة

الملخص

المصدر: Tark-Dame, M., et al. توليد نباتات معدلة وراثيا مع إدخالات أحادية النسخة باستخدام المتجه الثنائي BIBAC-GW. J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، نوضح جيلا من نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا مستقرة من خلال التحول الجيني الثنائي القائم على الكروموسوم الاصطناعي بوساطة Agrobacterium.

البروتوكول

< p class = "jove_title" > 1. نبات الأرابيدوبسيس التحول

1. تحضير نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس للتحول.
   1. قم بزراعة نباتات نبات الأرابيدوبسيس في دفيئة أو غرفة نمو يتم التحكم فيها بالمناخ حتى تزهر (12 أصيصا مع 9 نباتات لكل غمس).
   2. قم بقص البراغي الأولى للسماح بظهور المزيد من البراغي الثانوية. تكون النباتات جاهزة للغطس بعد 4-6 أيام من القص ، عندما تحتوي النباتات على العديد من رؤوس الزهور غير الناضجة وليس لديها الكثير من السيليكات المخصبة.
2. غمس الأزهار
   1. اغمس النورات لمدة 5-10 ثوان في معلق Agrobacterium الذي يحمل T-DNA المستنسخ باستخدام كروموسوم اصطناعي بكتيري ثنائي أو BIBAC. استخدم التحريض اللطيف.
   2. لف الأجزاء الموجودة فوق سطح الأرض من النباتات في غلاف بلاستيكي للحفاظ على الرطوبة عالية ، وقم بتغطية أواني النباتات بصندوق لإبقاء النباتات في الظلام. احتضان النباتات لمدة يومين في غرفة دفيئة / نمو.
   3. قم بإزالة الصندوق وفيلم التشبث وقم بزراعة النباتات حتى تنضج في دفيئة / غرفة نمو.
      ملاحظه: لزيادة كفاءة التحول ، يمكن إعادة غمس نفس النباتات بعد 7 أيام من الغمس الأول.
   4. احصد البذور. قم بتجميع وتحليل بذور النباتات (T1) ، التي تم تحويلها بنفس البنية ، كمجموعة واحدة.
3. فحص للنباتات المعدلة وراثيا.
   1. للكشف عن النباتات المعدلة وراثيا التي تم تحويلها باستخدام مشتق pBIBAC-RFP-GW ، قم بتحليل البذور باستخدام الفحص المجهري الفلوري. من أجل اكتشاف تعبير DsRed في طبقات البذور ، قم بتصوير البذور عند إثارة 560 نانومتر وانبعاث 600-650 نانومتر. افصل البذور الفلورية عن نظيراتها غير الفلورية باستخدام الملقط.
   2. للكشف عن النباتات المعدلة وراثيا التي تم تحويلها بمشتق pBIBAC-BAR-GW ، زرع البذور في صواني مملوءة بالتربة (~ 2,500 بذرة / 0.1 م²). لضمان الانتشار المتساوي للبذور على الصواني ، قم بتعليق البذور في أجار 0.1٪ في وسط Murashige Skoog 0.5x (MS) ، وانشر البذور باستخدام ماصة سعة 1 مل.
      ملاحظه: لتحفيز البذور على الإنبات بطريقة متزامنة ، احتضان البذور لمدة يومين على الأقل عند 4 درجات مئوية. يمكن القيام بذلك قبل أو بعد زرع البذور.
      1. رش الشتلات بمحلول جلوفوسينات الأمونيوم بنسبة 0.5٪ بعد أسبوعين و 3 أسابيع من البذر في الصواني. استخدم 500 مل من محلول جلوفوسينات الأمونيوم لكل 1 م².
      2. انقل الشتلات الباقية إلى أواني فردية. تظهر صورة نموذجية لصينية بها شتلات قبل وبعد معالجة الجلوفوسينات والأمونيوم (الثانية) في الشكل 1.
      3. قم بتحليل النباتات المقاومة للأمونيوم الجلوفوسينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لوجود البنية ذات الأهمية.
         1. عزل الحمض النووي الجيني للنبات التفاعلي (PCR).

النتائج

الشكل 1: صينية مملوءة بشتلات نبات الأرابيدوبسيس قبل وبعد معالجة Glufosinate-ammonium. تموت الشتلات التي لا تعبر عن جين الشريط الموجود في pBIBAC-BAR-GW T-DNA بعد رشها بمحلول Glufosinate-ammonium. تظهر الصور نفس صينية الشتلات (أ) قبل الرش بغلوفوسينات الأمونيوم ، بعد 14 يوما من البذر ، و (ب) بعد 10 أيام ، بعد رشها مرتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كبريتات كاناميسين أحادي الهيدرات دوشيفا ك 0126 مزيج إنزيم كلوناز Gateway LR Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019 Murashige Skoog وسط دوشيفا M0221 اجار دينار بحريني هاتف: 214010 جلوفوسينات الأمونيوم (باستا) باير 79391781 تصوير الفوسفور جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة إعصار FLA 7000 فيلم التشبث (التفاف ساران) أومنيلا 1090681 أغاروز Thermo Scientific - Invitrogen 16500