تحرير الجينات بوساطة مورفولينو: تقنية ضربة قاضية للجينات باستخدام الحظر الانتقالي لقليل النوكليوتيدات مورفولينو في بيض أسماك الكهف أحادية الخلية

الملخص

المصدر: Stahl، B. A. et al.، التلاعب بوظيفة الجينات في أسماك الكهف المكسيكية. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية ضربة قاضية للجينات باستخدام مورفولينوس الحجب الانتقالي المحقون في مرحلة الخلية الواحدة من أسماك الكهف. Morpholinos عبارة عن قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي ترتبط بالتسلسل التكميلي ل mRNA المستهدف وتمنع ترجمته إلى بروتين. وبالتالي ، يتم استخدام المورفولينو كأدوات جزيئية لإيقاف أو تقليل تعبير الجين بشكل عابر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تصميم مورفولينو أوليغو

ملاحظة: تسلسلات A. mexicanus متاحة من خلال المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) Gene و NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ، وكذلك من متصفح الجينوم Ensembl (https://www.ensembl.org). عند تصميم مورفولينو للاستخدام في كل من الأشكال السطحية والكهوف ، من الأهمية بمكان تحديد أي تباين جيني بين الأشكال في هذه المرحلة ، لذلك يمكن تجنب هذه المناطق الجينية كأهداف للمورفولينوس. يمكن أن يؤدي أي اختلاف متعدد الأشكال داخل موقع مستهدف مورفولينو إلى ربط غير فعال. يشبه التصميم أنظمة الأسماك الأخرى ، مثل أسماك الزرد ، وقد ثبت سابقا أنه يعمل بفعالية في A. mexicanus.

1. تصميم مورفولينوس حجب الترجمة
   ملاحظه: تمنع مورفولينوس التي تمنع الترجمة الترجمة عن طريق الارتباط بموقع البداية الداخلي وتمنع الآلية الانتقالية من ربط تسلسل الرنا المرسال من خلال عائق فراغي.
   1. حدد منطقة الترميز للجين المستهدف بدءا من موقع بدء ATG.
   2. سجل أول 25 زوجا أساسيا من التسلسل المستهدف عن طريق نسخ التسلسل ولصقه في محرر نصوص أو دفتر ملاحظات مختبر.
   3. باستخدام أي برنامج عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، http://reverse-complement.com) أو الترجمة اليدوية ، قم بإنشاء المكمل العكسي للتسلسل المستهدف. احفظ المكمل العكسي الناتج في محرر نصوص أو دفتر ملاحظات مختبر.
   4. اطلب مورفولينو بالتسلسل التكميلي العكسي من شركة تولد المورفولينو قليل النوكليوتيدات. انظر جدول المواد للشركات.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الحقن المجهري

1. تحضير الأدوات العامة للحقن < br / > ملاحظه: تم وصف الإجراءات الواردة في هذا القسم بالتفصيل في مكان آخر ، ويتم تقديم نظرة عامة مع تعديلات طفيفة هنا.
   1. قم بإنشاء ألواح حقن عن طريق صب 3٪ من الاغاروز الدافئ المذاب في ماء نظام السمك في طبق بتري سعة 100 مل. ضع قالب حقن البيض بحذر في الاغاروز المصبوب حديثا لعمل آبار لبيض السمك. ضع جانب القالب في أجار بزاوية 45 درجة ثم قم بخفضه ببطء في الاغاروز ؛ يؤدي خفض القالب ببطء بزاوية إلى تجنب احتجاز الهواء تحت القالب. قم بإزالة القالب برفق بمجرد أن يتماسك الاغاروز. يمكن تخزين الألواح وإغلاقها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. جمع بيض أحادي الخلية
   1. في الليلة التي يتوقع فيها التكاثر ، افحص الخزانات كل 15-30 دقيقة وراقب وجود بيض في قاع الخزان. يبدو البيض شفافا ، ويبلغ قطره حوالي 1 مم.
   2. استخدم شبكة سمك شبكية دقيقة لجمع البيض ونقله إلى وعاء زجاجي مملوء بمياه نظام الأسماك العذبة. افحص البويضات تحت المجهر للتأكد من أن البويضات في مرحلة الخلية الواحدة.
   3. باستخدام الماصات الزجاجية، انقل البويضات أحادية الخلية إلى ألواح الحقن. الماصات الزجاجية مطلوبة في هذه المرحلة حيث يلتصق البيض بالبلاستيك.
   4. باستخدام ماصة ، حرر البيض بعناية في آبار صفيحة حقن الاغاروز من القسم 2.1. املأ صفوف لوحة الحقن المسخنة مسبقا (في درجة حرارة الغرفة) بأكبر عدد ممكن من البيض (30-40 لكل صف ، وما يصل إلى خمسة صفوف). تساعد الصفوف الكاملة على منع البيض من الحركة أثناء الحقن. حافظ على رطوبة البيض على طبق الحقن بكمية صغيرة من ماء نظام السمك حتى أداء الحقن.
3. إرشادات إعداد حقن بيكو وتحسين الحقن العامة
   1. قم بإعادة ملء إبر الحقن باستخدام أطراف ماصة محملة بالهلام تتناسب مع الشعيرات الدموية أو باستخدام أطراف ماصة دقيقة قياسية وإضافة بلعة 2-4 ميكرولتر إلى النهاية. بمجرد ملء الإبرة ، استخدم الملقط لتقليم الطول الزائد من إبرة الحقن.
   2. إجراء الحقن المجهري باستخدام إبرة مثبتة في مناور دقيق ، متصل بحاقن بيكوليتر دقيق.
   3. اضبط وقت الحقن على 0.03 ثانية والضغط عند ~ 0.0 رطل لكل بوصة مربعة. سيختلف ضغط الحقن وفقا لذلك مع وجود اختلافات طفيفة بين الإبر ، لذا قم بتحسينها لتحقيق بلعة حقن ~ 1.0 nL.
      ملاحظه: غالبا ما يكون ضغط الحقن في حدود ~ 10-30 رطل لكل بوصة مربعة.
   4. قم بتوحيد بلعة الحقن عن طريق الحقن في الزيت المعدني وقياس حجم البلعة باستخدام ميكرومتر منزلق لتحقيق حجم حقن ~1-1.5 نانولتر. اضبط ضغط الحقن (psi) لزيادة حجم البلعة أو تقليلها.
   5. اسحب الماء من الجزء العلوي من البيض باستخدام منديل مختبر.
      ملاحظه: مشيمة بيض أستياناكس أصعب قليلا في الاختراق من بيض الزرد. نجد أن سحب الماء من الجزء العلوي من البيض يساعد في تسهيل تغلغل الإبرة في البيضة. يمكن أن يسمح تحسين اللوحة ب ~ 200 بيضة على طبق واحد.
   6. استخدم أداة المعالجة الدقيقة لاختراق كل بيضة بالإبرة وحقنها مباشرة في صفار البيض. بمجرد وضعها في صفار البيض ، قم بحقن البيضة بالضغط على زر الحقن أو دواسة قدم الحقن.
      ملاحظه: يمكن حقن لوحة كاملة في غضون ~ 15 دقيقة. تستمر المرحلة أحادية الخلية لمدة ~ 40 دقيقة.
4. حقن مورفولينوس
   ملاحظه: يجب تحسين كمية المورفولينو اللازمة للضربة القاضية دون التسبب في السمية لكل هدف جيني. ومع ذلك ، فإن تركيز 400 بيكوغرام هو مكان جيد للبدء.
   1. تحضير مورفولينو بحيث يتم حقن 400 بيكوغرام من المورفولينو لكل بيضة. قم بإذابة المورفولينو على الجليد. يتكون محلول الحقن من مورفولينو (بالتركيز المطلوب) ، و H2O الخالي من RNase أو محلول Danieau ، وأحمر الفينول (10٪ من الحجم النهائي). على سبيل المثال، انظر الجدول 1.
   2. حقن 1 nL لكل جنين.

المواد