Tol2 Transgenesis Zebrafish بوساطة الينقولات: إجراء لتوليد أسماك الزرد المعدلة وراثيا بعد الحقن المشترك لنظام Tol2 في أجنة أسماك الزرد المخصبة

الملخص

المصدر: Silic، M. R.، et al. تصور النشاط الكهربائي الخلوي في الأجنة والأورام المبكرة لأسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء لتوليد خط معدل وراثيا مستقر لأسماك الزرد يعبر بشكل أساسي عن بروتين مؤشر جهد الفلورسنت بعد الحقن المشترك لنظام الينقولات Tol2 الذي يشتمل على الترانسبوزياز mRNA و Tol2 ينقولات ترميز مؤشر الجهد الفلوري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة < ص = "jove_title" >1. الحقن المجهري

1. قم بإعداد 4-6 خزانات تكاثر مع ما لا يقل عن ذكرين و 2 أنثى بعد الظهر قبل الحقن. يجب عدم إطعام هذه الأسماك في فترة ما بعد الظهر. ستقلل هذه الخطوة من كمية نفايات الأسماك وتوفر الوقت لتنظيفها في صباح اليوم التالي ، مع المساعدة أيضا في تحفيز استجابة التكاثر.
2. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الحقن المحضر الذي يتألف من: (أنا) بنية ينقولات Tol2 تحتوي على محفز يوبيكويتين لأسماك الزرد وجين مؤشر الجهد الفلوري المستشعر المعجل لإمكانات العمل 1 (ASAP1) ، و (ثانيا) Tol2 mRNA ، من الفريزر -80 درجة مئوية ، وضعه على الجليد.
3. اسحب الفواصل في أحواض تربية الأسماك واترك الأسماك تتزاوج. بشكل عام ، تضع الأسماك البيض في غضون 20-30 دقيقة بعد سحب المقسم. إذا لم يكن كذلك ، انتظر 1-2 ساعة أطول. قد لا تضع بعض الأسماك البيض على الإطلاق. في هذه الحالة ، كرر هذه التجربة لجمع أجنة الأسماك.
4. أثناء الانتظار ، تأكد من وجود إبر معدة مع كسر الطرف بزاوية تخلق حافة مشطوفة بالملقط ، أو عن طريق كسر ممسحة مهمة دقيقة.
   1. اسحب الإبر من الزجاج الشعري على مجتذب ماصة دقيقة باستخدام المعلمات التالية: الحرارة 545 ؛ السحب 60 ؛ السرعة 80 ؛ الوقت 250 ؛ الضغط 500. اكسر الإبرة بالملقط أسفل نطاق التشريح (باستخدام مسطرة من قطعة العين لتقدير القطر) عن طريق إمساك الملقط بزاوية 45 درجة تقريبا. يمكن أن تكون أقطار الإبرة المرغوبة متغيرة اعتمادا على إعدادات الحاقن الدقيق ، ولكن يفضل القطر الأصغر لتقليل معدل وفيات الأجنة.
5. بمجرد أن تضع الأسماك البيض ، اجمعها في طبق بتري قطره 10 سم وأحضرها إلى نطاق التشريح. قم بإزالة جميع الأجنة غير الطبيعية ومخلفات الأسماك.
6. قم بسحب الأجنة المخصبة في قالب حقن الاغاروز المحضر بنسبة 3٪. قم بإزالة الماء الزائد للمساعدة في الحفاظ على الأجنة في مكانها.
7. بمجرد أن تمتلئ جميع الصفوف بأجنة قابلة للحياة ، قم بترتيبها بحيث تواجه جميع الخلايا المفردة نفس الاتجاه نحو الإبرة ، والتي تبلغ بزاوية 45 درجة أفقيا تقريبا. هذا سيجعل الحقن أسهل بكثير في وقت لاحق.
8. أثناء ارتداء القفازات ، استخدم طرف ماصة تحميل سعة 20 ميكرولتر وقم بإزالة 5 ميكرولتر من الهيكل المحضر من الأنبوب الموجود على الجليد.
9. أدخل الطرف بحذر في الطرف الخلفي للأنبوب الشعري المكسور على طول الطريق إلى حيث يبدأ في التناقص ، للحصول على الكاشف بالقرب من الحافة. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء ، هز الإبرة ، وتأكد من عدم كسر الحافة.
10. أدخل الإبرة مباشرة في حامل إبرة الحقن المجهري وشد بعناية حتى تبقى الإبرة في مكانها. اضبط الزاوية على حوالي 45 درجة.
11. بمجرد تحضير الإبرة وتثبيتها ، قم بتشغيل المجهر وخزان ضغط الغاز. تعتبر خزانات ثاني أكسيد الكربون_{التجارية} جيدة بشكل عام لهذا الغرض. يتم ضبط حجم الحقن عن طريق الضغط الاحتجاز والطرد: تقريبي 0.5 رطل لكل بوصة مربعة للاحتفاظ و 30 رطل لكل بوصة مربعة للطرد. تأكد من التحقق من خروج المحلول عند الضغط على الدواسة.
12. باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني ، اضبط حجم وتدفق المحلول إلى ~ 150 ميكرومتر في القطر (حوالي 2 نانولتر). تأكد من أن الضغط الخلفي سيسمح بكمية صغيرة من الخروج من الإبرة. إذا لم يكن هناك ضغط خلفي كاف ، فإن العمل الشعري سيؤدي إلى دخول السائل إلى الإبرة وتدمير الرنا المرسال.
13. بمجرد معايرة الإبرة ، ابدأ في حقن البناء في الخلية المفردة للأجنة المخصبة.
    ملاحظه: هذا يتطلب قدرا كبيرا من الممارسة, صبر, والبراعة, بسبب غشاء الخلية يجري من الصعب أن اخترق. من المهم حقن المحلول في الخلية ، وليس صفار البيض ، لتوليد سمك الزرد المعدل وراثيا. هذا يختلف عن حقن مورفولينو. لا يهم أي جانب تدخل الإبرة إلى الخلية طالما أن البناء يذهب في الخلية. سيكون للتحول معدل نجاح منخفض جدا إذا تم حقنه في صفار البيض بدلا من الخلية. من المهم أيضا حقن المرحلة المفردة ، أو سيتم إنشاء أسماك الوهم الجسدية. سيقلل هذا من فرصة دخول الجينات المعدلة وراثيا إلى الخلايا الجرثومية.
14. استخدم حافة شق الجل لتوفير دعامة تحافظ على الجنين في مكانه وتسمح للإبرة بالضغط دون تحريك الجنين. بمجرد أن يصبح طرف الإبرة في الخلية المفردة ، اضغط على الدواسة لتحرير الكمية المطلوبة من المحلول. كرر هذه العملية لجميع الأجنة.
15. عند الانتهاء ، انقل الأجنة المحقونة إلى طبق مكتوب عليه عن طريق شطفها من شق الاغاروز بماء نظام السمك وماصة نقل 3.4 مل يمكن التخلص منها. قم بتخزين الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح لها بالنمو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز آر إيه أمريسكو N605-500G لصنع المواد الهلامية للحقن نطاق تشريح المجال الساطع نيكون SMZ 745 dechorionation ، الحقن المجهري ، التركيب ماصة نقل يمكن التخلص منها 3.4 مل الترمو: العلمية 13-711-9 صباحا أجنة الأسماك ونقل المياه ملقط # 5 WPI 500342 التآكل وكسر الإبرة نصيحة التحميل إيبندورف 930001007 لتحميل محلول الحقن في الإبر الكابيلاري قالب الحقن الدقيق أدوات العلوم التكيفية TU-1 لتحضير صينية قوالب agaorse لحمل أجنة الأسماك أثناء الحقن حاقن دقيق WPI مضخة بيكو هوائية PV820 حاقن الحقن المجهري مناور دقيق WPI حاقن دقيق MM3301R عملية الحقن المجهري مجتذب الماصات الدقيقة أداة Sutter ف -1000 لتحضير إبرة شعرية الزيوت المعدنية أمريسكو J217-500 مل لمعايرة حجم الحقن أطباق بتري البلاستيكية VWR هاتف: 25384-088 لحمل أجنة الأسماك أو الأسماك أثناء عملية التصوير المرحلة ميكرومتر نطاق أنا MR100 معايرة حجم الحقن المجهري الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار WPI TW100F-4 الزجاج الخام لصنع إبرة كابلياري