تحرير الجينات بوساطة الينقولات PiggyBac في iPSCs البشرية: إجراء لدمج الجينات ذات الأهمية في iPSCs البشرية باستخدام نظام الينقولات PiggyBac

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Garone ، M. G. et al. تحويل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان (iPSCs) إلى الخلايا العصبية الحركية الشوكية والجمجمة الوظيفية باستخدام ناقلات PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

< ص الفئة = "jove_content">يوضح هذا الفيديو الإجراء لتوليد الخلايا العصبية الحركية عن طريق تعدي iPSCs البشرية باستخدام نظام الينقولات PiggyBac عن طريق التعبير خارج الرحم لعوامل النسخ الخاصة بالنسب.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. توليد خطوط iPSC المحفزة NIL و NIP

1. تعداء الخلية
   1. اشطف الخلايا باستخدام PBS (خال من Ca^{2 +/}Mg²⁺).
   2. أضف كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) (0.35 مل لطبق 35 مم) واحتضانه عند 37 درجة مئوية حتى تصبح الخلايا المفردة
   3. مفصولة (5-10 دقائق).
   4. أكمل فصل الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 3-4 مرات.
   5. اجمع في أنبوب سعة 15 مل وأضف PBS (Ca^{2 + /} Mg²⁺ مجانا) إلى 10 مل. عد الخلايا.
   6. بيليه 10⁶ خلايا وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من Buffer R (مضمنة في مجموعة التثقيب الكهربائي للخلية ، انظر جدول المواد).
   7. أضف الحمض النووي البلازميد للتعداد: 4.5 ميكروغرام من ناقل التحويل (epB-Bsd-TT-NIL أو epB-Bsd-TT-NIP) و 0.5 ميكروغرام من بلازميد الترانسبوزيت piggyBac.
   8. قم بعمل جهاز التفريغ الكهربائي للخلية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع المعلمات التالية: جهد 1,200 فولت ، عرض 30 مللي ثانية ، نبضة واحدة. زرع الخلايا في وسط iPSC البشري مكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط الصخرة, انظر جدول المواد) في 6 مم المغلفة المصفوفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ب 27 ميلتيني بيوتيك 130-093-566 مكمل غذائي خال من المصل للحفاظ على الخلايا العصبية بامبانكر علم الوراثة نيبون NGE-BB02 وسط تجميد الخلايا لأسلاف الخلايا العصبية الحركية كلوريد_{الهواء 2} سيجما ألدريتش سي 3881 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية مصفوفة كورنينج ماتريجل hESC المؤهلة كورنينج 354277 تحضير الغشاء القاعدي المعاد تشكيله من ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). تستخدم لالتصاق iPSC بالدعامات البلاستيكية والزجاجية وسائط تجميد ACF CRYOSTEM الصناعات البيولوجية 05-710-1ه وسط التجميد ل iPSCs البشرية متباينة جيبكو 17105-041 كاشف للتفكك اللطيف لمركبات iPSCs البشرية DMEM / F12 سيجما ألدريتش D6421-500 مل الوسط القاعدي لزراعة الخلايا الدوكسيسيكلين سيجما ألدريتش D9891-1G تستخدم للحث على التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا من نواقل epB-Bsd-TT-NIL و epB-BSD-TT-NIP DS2U واي سيل UWWC1-DS2U خط iPSC البشري التجاري GDNF PreproTech 450-10 عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقي خط Gibco episomal hiPSC ثيرمو فيشر العلمي أ 18945 خط iPSC البشري التجاري هيبس سيجما ألدريتش إتش 4034 المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية لامينين سيجما ألدريتش 11243217001 يعزز تعلق ونمو الخلايا العصبية في المختبر NEAA ثيرمو فيشر العلمي 11140035 الأحماض الأمينية غير الأساسية. تستخدم كمكمل لوسط زراعة الخلايا ، لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للحياة. طقم نيون 100 ميكرولتر ثيرمو فيشر العلمي MPK10096 طقم التثقيب الكهربائي للخلايا نظام تعداء النيون ثيرمو فيشر العلمي MPK5000 نظام التثقيب الكهربائي للخلية الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي 21103049 وسط قاعدي مصمم للصيانة والنضج على المدى الطويل لمجموعات الخلايا العصبية دون الحاجة إلى طبقة مغذية للخلايا النجمية NutriStem-XF / FF الصناعات البيولوجية 05-100-1 أ وسيط ثقافة iPSC البشري برنامج تلفزيوني Ca^{2 +/}Mg²⁺ مجانا سيجما ألدريتش D8537-500 مل محلول ملحي للفوسفات من Dulbecco ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P4333-100 مل يستخدم محلول البنسلين / الستربتوميسين لمنع تلوث زراعة الخلايا من البكتيريا. Y-27632 (مثبط الصخور) إنزو لعلوم الحياة ألكس-270-333-M005 مثبط انتقائي منفذ للخلية لملف ملفوف مرتبط ب Rho يحتوي على بروتين كيناز (ROCK). يزيد من بقاء iPSC