$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تثبيت البرنامج
- اتبع التعليمات لتثبيت البرنامج من https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
2. تحضير الكواشف والماصات
- الاغاروز: قم بإعداد 3٪ من الاغاروز عن طريق إذابة 3 جم من الاغاروز واسع النطاق و 3 جم من الاغاروز منخفض نقطة الانصهار بشكل منفصل في 100 مل من PBS من فئة زراعة الخلايا في زجاجتين منفصلتين سعة 200 مل ، على التوالي. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- محلول Tyrode: قم بإذابة 1 جم من بيكربونات الصوديوم وملح Tyrode (استخدم محتوى الزجاجة بأكملها) و 13 مل من 1 M HEPES في 1 لتر من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر.
- وسط زراعة الشرائح (SCM): أضف 10 مل من مصل الفئران ، 1 مل من 2 ملي جلوتامين ، 1 مل من البنسلين - الستربتومايسين (100x) ، 1 مل من مكمل N-2 (100x) ، 2 مل من مكمل B27 (50x) و 1 مل من HEPES (درجة الحموضة 7.3) في 84 مل من الوسط العصبي القاعدي. Aliquot 5 مل من SCM في أنابيب 15 مل. يحفظ في -20 درجة مئوية.
- وسيط الحقن المجهري المستقل ثنائي أكسيد الكربون (CIMM): قم بإعداد محلول منخفض الجلوكوز معدل 5x DMEM (بدون أحمر الفينول) عن طريق إذابة المسحوق في 200 مل من الماء المقطر. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر (بالنسبة لمسحوق DMEM، استخدم محتوى الزجاجة بأكملها). لتحضير 100 مل من CIMM ، اخلطي 20 مل من محلول معدل 5x DMEM ، و 1 مل من محلول HEPES ، و 1 مل من مكمل N2 (100x) ، و 2 مل من مكمل B27 (50x) ، و 1 مل من البنسلين - الستربتومايسين (100x) ، و 1 مل من 2 ملي مولار من الجلوتامين و 74 مل من الماء المقطر. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- المخزن المؤقت لإعادة التكوين: قم بإعداد المخزن المؤقت لإعادة التكوين عن طريق إذابة 262 ملي مولار من هيدروكسيد الصوديوم ، 0.05 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم ، 200 ملي مولار HEPES في الماء المقطر. قم بتعقيم المحلول عن طريق الترشيح من خلال نظام فلتر 0.22 ميكرومتر في زجاجة زجاجية معقمة. Aliquot 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة محكمة الإغلاق. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- مخزون صبغة الحقن المجهري: قم بإذابة ديكستران المسمى بالفلورسنت في الماء المقطر الخالي من RNase (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / ميكرولتر). تحضير 5 ميكرولتر من الكميات وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- اسحب ماصات الحقن الدقيق من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (القطر الخارجي 1.2 مم، القطر الداخلي 0.94 مم) باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة. حماية الماصات من الغبار. لا تقم بتخزين الماصات لأكثر من 2-3 أيام. بالنسبة لهذه التجربة ، كانت معلمات السحب HEAT: درجة حرارة المنحدر +1 - 5 ؛ السحب: 100 ؛ : 110 ؛ ديل: 100. HEAT و VEL هما المعلمان اللذان يؤثران على شكل الماصة وحجمها الأكبر.
ملاحظه: تتميز ماصة الحقن المجهري المثالية بطرف طويل ومرن لتجنب تلف الخلايا أثناء الحقن المجهري.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير شريحة المناديل
- قم بإذابة الاغاروز واسع النطاق بنسبة 3٪ باستخدام فرن الميكروويف قبل تشريح أنسجة المخ. لا تدع الاغاروز يتجمد عن طريق الاحتفاظ به في حمام مائي عند 37 درجة مئوية قبل التضمين. تأكد من حماية الماصات من الغبار. لا تقم بتخزين الماصات لأكثر من 2-3 أيام.
- قم بإذابة كمية من SCM وقم بتسخين 10-12 مل CIMM و 20 مل من محلول Tyrode إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
- امزج متتبع الفلورسنت (Dextran-3000 أو Dextran-10000-Alexa المترافق ؛ التركيز النهائي 5-10 ميكروغرام / ميكرولتر) مع المادة (المواد الكيميائية) الأخرى المراد حقنها. الطرد المركزي لمحلول الحقن المجهري عند 16 ، 000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد. احتفظ بمحلول الحقن المجهري على الثلج حتى الاستخدام.
- استخدم رؤوس أجنة الفئران E13.5-E16.5 لتحضير شرائح الأنسجة العضوية من الدماغ الكهربائي. قم بإزالة الجلد وافتح الجمجمة باستخدام الملقط ، وتحرك على طول خط الوسط. قم بتشريح الدماغ الجنيني من الجمجمة المفتوحة وإزالة السحايا التي تغطي أنسجة المخ بدءا من الجانب البطني من الدماغ. اترك الدماغ كله المقطوع في محلول Tyrode على كتلة تسخين 37 درجة مئوية.
ملاحظه: يجب تنفيذ جميع خطوات التشريح الموضحة في 3.4 في محلول Tyrode الدافئ مسبقا.
- صب مجموعة واسعة من الاغاروز المذاب في قالب تضمين يمكن التخلص منه. عندما يتم تبريد الاغاروز إلى 38-39 درجة مئوية ، انقل الأدمغة بعناية (بحد أقصى 4) إليه باستخدام ماصة باستور. استخدم دائما نصائح القطع لهذه الخطوة.
- حرك الاغاروز حول الأنسجة إما باستخدام ملعقة أو زوج من ملقط Dumont # 1 دون لمس الأنسجة. دع الاغاروز يتجمد في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يتجمد الاغاروز ، قم بقص الاغاروز الزائد المحيط بالأنسجة.
- املأ الدرج المؤقت ببرنامج تلفزيوني. قم بتوجيه الدماغ بالمحور الذيلي الوردي للأنسجة العمودي على الدرج (استخدم كمعلم للمصابيح الشمية ، التي تمثل الجزء الأكبر من الدماغ). قطع شرائح 250 ميكرومتر باستخدام اهتزاز.
- املأ طبق بتري مقاس 3.5 سم ب 2 مل من الوسائط الدافئة مسبقا. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، انقل الشرائح (10-15) إلى هذا الطبق. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتحويل طبق بتري مع الشرائح إلى حاضنة ثقافة الشرائح. يحفظ الشرائح عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 40٪ O2 / 5٪ CO2 / 55٪ N2 حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >
4. الحقن المجهري
- قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر وكاميرا المجهر والمتلاعبين وجهاز الضغط ومستشعر الضغط. قم بتحميل التطبيق بالنقر فوق الملف "launchapp.py" في المجلد الرئيسي الذي تم تنزيله من GitHub وحدد إعدادات الجهاز في الشاشة المنبثقة (انظر الخطوة 1.1 للحصول على إرشادات التثبيت).
- قم بإنشاء ضغط خارجي لمنع الانسداد غير المرغوب فيه قبل غمر الماصة في المحلول. لتطبيق الضغط على الماصة، حرك شريط ضغط التعويض إلى 24-45٪ وانقر فوق تعيين القيم. بعد ذلك ، اضبط الضغط على ضغط كاف عن طريق تدوير مقبض صمام الضغط الميكانيكي إلى 1-2 رطل لكل بوصة مربعة (69-138 ملي بار) كما هو موضح بواسطة مستشعر الضغط.
- انقل الشرائح إلى طبق بتري مقاس 3.5 سم يحتوي على 2 مل من CIMM المسخن مسبقا. ضع الشرائح المراد حقنها في وسط طبق بتري. انقل طبق بتري إلى مرحلة الحقن المجهري المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
- قم بتحميل ماصة الحقن المجهري بسعة 1.4-1.6 ميكرولتر من المحلول المحقون الدقيق (من الخطوة 3.3) باستخدام ماصة بلاستيكية طويلة الطرف. أدخل ماصة الحقن الدقيق في حامل الماصة.
- باستخدام أقل تكبير على المجهر، اجعل الشريحة في بؤرة التركيز وقم بتوجيه الماصة الدقيقة إلى مجال الرؤية هذا (FOV) بحيث يتم تركيزها على نفس مستوى هدف الشريحة. قم بتبديل إخراج المجهر إلى الكاميرا لرؤية مجال الرؤية في التطبيق.
- انقر فوق زر التكبير في الجزء العلوي الأيسر من الواجهة لبدء معايرة الجهاز. ستطالب نافذة بتحديد التكبير. حدد التكبير بمعدل 10 أضعاف، أو أي تكبير تم ضبط العدسة عليه (على سبيل المثال، 4x أو 10x أو 20x أو 40x) واضغط على Ok. يفترض البرنامج أن العدسة الموضوعية الداخلية هي 10x (تكبير العدسة الشيئية الأكثر شيوعا).
- أعد تركيز طرف الماصة باستخدام العجلة الميكرومترية للمجهر وانقر فوق طرف الماصة بالمؤشر. بعد ذلك ، اضغط على زر الخطوة 1.1 واضغط على "موافق" في النافذة المنبثقة. سوف تتحرك الماصة في الاتجاه Y. انقر فوق طرف الماصة واضغط على زر الخطوة 1.2. أخيرا ، أدخل 45 في مربع زاوية الماصة واضغط على زاوية الضبط.
- أدخل المعلمات المطلوبة في لوحة التحكم في الحقن الدقيق الآلي. بالنسبة للحقن المجهري في الأسلاف القمية ، اضبط مسافة الحقن على 20-40 ميكرومتر والعمق على 10-15 ميكرومتر. بالنسبة للحقن المجهري في الخلايا العصبية ، اضبط مسافة الحقن 30-40 ميكرومتر من الجانب القاعدي ، والعمق إلى 10-30 ميكرومتر اعتمادا على ما يتم استهدافه. اضبط السرعة دائما على 100٪. انقر فوق تعيين القيم.
ملاحظه: مسافة الاقتراب هي المسافة التي تسحبها الماصة من الأنسجة قبل الانتقال إلى مسافة الحقن التالية، والعمق هو عمق الأنسجة التي يذهب إليها الحقن المجهري، والتباعد هو المسافة على طول الخط الفاصل بين الحقن المتسلسل، والسرعة هي سرعة الماصة بالميكرومتر/ثانية.
- انقر على ارسم حافة زر واسحب المؤشر على طول المسار المطلوب في النافذة المنبثقة لتحديد مسار الحقن. بالنسبة للحقن الدقيق للخلايا الجذعية السلفية ، يتم استهداف الجانب البطني من سطح الدماغ الكهربائي. أحضر الماصة إلى بداية الخط وانقر فوق طرف الماصة. انقر فوق Run trajectory لبدء الحقن المجهري. كرر هذه الخطوة لكل مستوى من الحقن المستهدف (عادة ما يتم إجراؤه ل 3-4 طائرات مع 40-75 حقنة لكل طائرة).