الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات المرحلة العكسية: طريقة قوية لتقدير كمية أحماض السياليك المصنفة والمشتقة من الفلورسنت المعزولة من كبد الفأر

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Cao، C. et al. تحديد أحماض السياليك في عينات الكبد والحليب من الفئران البرية و CMAH بالضربة القاضية.J. Vis. Exp.(2017)

في هذا الفيديو ، نوضح الكشف عن أحماض السياليك وحمض N-acetylneuraminic وحمض N-glycolylneuraminic ، باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، HPLC ، بعد الاشتقاق باستخدام كاشف وضع العلامات الفلورية المناسب للمساعدة في الكشف عن التألق.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. اشتقاق الأحماض السياليك الفلورية

1. تحضير 10 مل من محلول العيادات الخارجية ، يتكون من 100 مجم من o-phenylenediamine و 208 مجم من كبريتات هيدروجين الصوديوم في 10 مل من H₂O المقطر.
2. أضف 20 ميكرولتر من محلول العيادات الخارجية إلى عينات حمض السياليك. دوامة بقوة لمدة 30 ثانية واحتضان العينات لمدة 4 ساعات عند 80 درجة مئوية في الظلام (أي لف الأنابيب الدقيقة بورق الألمنيوم).
3. دع العينات تبرد لمدة 5 دقائق ، أضف 80 ميكرولتر من H₂O المقطر وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 14,000 × جم لمدة دقيقة واحدة.
4. انقل 80 ميكرولتر من المادة الطافية إلى قارورة HPLC عالية الاسترداد سعة 300 ميكرولتر. يمكن تخزين عينات حمض السياليك المشتق عند 4-6 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

فئة

2. تحليل HPLC لمشتقات حمض السياليك

1. قم بتحليل العينات باستخدام نظام HPLC قياسي متصل بكاشف مضان عبر الإنترنت.
2. استخدم عمود C18 معكوس الطور بأبعاد قياسية بطول 250 مم وقطر 4.6 مم للتحليل.
3. تحضير المذيب A عن طريق تخفيف 200 مل من محلول المرق مع 800 مل من الماء من الدرجة LCMS (LCMS - قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة). يمكن تحضير محلول المخزون نفسه على النحو التالي:
   1. أضف 46 جم من حمض الفورميك إلى 800 مل من H₂O من الدرجة LCMS.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.5 عن طريق إضافة محلول هيدروكسيد الأمونيوم (puriss. p.a.).
   3. انقل المذيب إلى أسطوانة قياس واملأ ما يصل إلى 1,000 مل ب H₂O من الدرجة LCMS. يمكن تخزين محلول المخزون هذا في درجة حرارة 4-6 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
4. بالنسبة للمذيب B ، استخدم الأسيتونيتريل من الدرجة LCMS.
5. افصل مشتقات أحماض السياليك بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة مع شطف التدرج التالي:
   1. ابدأ بإضافة 10٪ من المذيب B الممزوج بالمذيب A.
   2. من 0 دقيقة إلى 15 دقيقة ، قم بزيادة نسبة المذيب B تدريجيا مع التدرج الخطي إلى 60٪.
   3. من 15 دقيقة إلى 16 دقيقة ، قم بزيادة نسبة المذيب B بسرعة مع تدرج خطي من 60٪ إلى 90٪. هذا يبدأ غسل عمود HPLC.
   4. لغسل عمود HPLC بشكل أكبر ، حافظ على مستوى المذيب B عند 90٪ بين 16 دقيقة و 18 دقيقة قبل تقليل مستوى المذيب B تدريجيا إلى 10٪ بين 18 دقيقة و 19 دقيقة.
   5. أعد موازنة عمود HPLC إلى ظروف البدء 10٪ B بين 19 و 24 دقيقة.
6. حقن 50 ميكرولتر من العينة في نظام HPLC.
7. راقب المواد المزيئة باستخدام الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث لكاشف التألق البالغة 373/448 نانومتر ، ويمكن توقع أحماض السياليك المشتقة في أوقات الاحتفاظ التقريبية البالغة 9 دقائق (ل Neu5Gc-OPD) و 10 دقائق (ل Neu5Ac-OPD).
8. احسب الكمية النسبية ل Neu5Gc (F_Neu5Gc) من مناطق ذروة التألق في Neu5Ac (A_Neu5Ac) و Neu5Gc (A_Neu5Gc) على النحو التالي:
   F_Neu5Gc [٪] = 100×A_Neu5Gc / (A_Neu5Ac + A_Neu5Gc). في حالة عينات الحليب والكبد من فأر Cmah متماثل اللواقح ، يجب أن تكون F_Neu5Gc 0٪ ، في حين أن قيم F_Neu5Gc للفئران غير المتجانسة الزيجوت والبرية قد تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على عمر الفأر ونوع الأنسجة (بين 2٪ و >90٪) مع هوامش خطأ متوقعة تبلغ ±12٪.

Materials