كروماتوغرافيا غاز Headspace: تقنية لتقييم تركيز الإيثانول في أجنة أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Lovely ، CB et al. القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة أسماك الزرد باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء للرأس. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو استخدام كروماتوغرافيا غاز مساحة الرأس لتحديد تركيزات الإيثانول في أجنة أسماك الزرد. توفر هذه الطريقة أداة مفيدة للتحليل النوعي والكمي للمركبات العضوية المتطايرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. قياس الحجم الجنيني باستخدام إزاحة الماء

< p class = "jove_content" >ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام أجنة بعد الإخصاب لمدة 24 ساعة (hpf) (الشكل 1). لا يتم استخدام الأجنة المستخدمة في قياسات الحجم في تحليل الإيثانول.

1. ضع 10 أجنة ووسائل خارج الجنين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مميز بحجم 250 ميكرولتر (الشكل 2 أ). أضف الماء إلى خط التعبئة 250 ميكرولتر (انظر العينة بالماء المصبوغ في الشكل 2 ب).
2. كرر الخطوة 1.1 لإعداد أوعية للأجنة التي تمت إزالة مشيقاتها.
   1. لإزالة المشيمة ، ضع الأجنة في المشيمات في طبق بتري 100 مم مع 2 مجم / مل من كوكتيل البروتياز في وسط الجنين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق. كل بضع دقائق ، قم بتدوير الأجنة برفق لكسر المشيمة.
   2. بمجرد أن تتحرر جميع الأجنة من المشيمة ، قم بإزالة الأجنة المتكللة من وسط كوكتيل / جنين البروتياز وضعها في طبق بتري جديد مقاس 100 مم مع وسائط جنينية جديدة لغسل الأجنة. كرر خطوة الغسيل هذه 1 مرة أخرى (ليصبح المجموع غسلتين). انقل الأجنة إلى طبق بتري طازج مقاس 100 مم.
3. باستخدام أصغر طرف ممكن ودون إتلاف الأجنة ، قم بإزالة كل السائل بعناية من حول الأجنة باستخدام ماصة دقيقة p200 (الشكل 2C) وقم بوزن الماء بمقياس بدقة <0.1 مجم. لتحديد حجم العينة المكونة من 10 أجنة ، اطرح وزن / حجم الماء (1 مل من الماء = 1 جم من الماء.) تمت إزالته من 250 ميكرولتر. لتحديد حجم جنين واحد ، اقسم الفرق بين 250 ميكرولتر ووزن الماء الذي تمت إزالته على 10.< / >
   

< p class = "jove_title" >2. معالجة الأجنة بالإيثانول

1. اجمع الأجنة من خزانات التزاوج وضعها في طبق بتري قياسي مقاس 100 مم. عد ما لا يزيد عن 100 جنين لكل طبق بتري واحد واحتضنه عند 28.5 درجة مئوية < br / > ملاحظه: إذا كان سيتم إزالة المشيمة (الخطوة 1.2) ، فيجب إزالتها قبل إضافة الإيثانول.
2. بمعدل 6 حصان في القدم ، أضف ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق بتري قياسي جديد مقاس 100 مم إما مع وسائط الجنين أو وسائط الجنين + 1٪ إيثانول (v / v). قم بتغطيته ، لكن لا تغلق طبق بتري. ضع الأجنة في حاضنة منخفضة الحرارة على 28.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة ، أو حتى تصل الأجنة إلى النقطة الزمنية للنمو البالغة 24 حصان.

< p class = "jove_title" >3. إعداد سير العمل قبل معالجة الأجنة لكروماتوغرافيا الغاز في مساحة الرأس

1. اصنع محلولا من 5 M كلوريد الصوديوم في الماء (ستكون هناك حاجة إلى 450 ميكرولتر لكل أنبوب عينة) لتغيير طبيعة جميع البروتينات ومنع استقلاب الإيثانول. اصنع كوكتيل البروتياز بتركيز 2 مجم / مل في وسط الجنين.
2. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقارورة كروماتوجراف غاز سعة 2 مل لكل عينة. قم بتسمية قوارير كروماتوجراف غاز إضافية سعة 2 مل لمعايير الإيثانول الموضحة أدناه بالإضافة إلى الهواء والماء وفراغات كوكتيل كلوريد الصوديوم / البروتياز 5 أمتار.
3. قم بإعداد ثلاثة ماصات دقيقة p200 تم ضبطها على 50 ميكرولتر، والمجموعة الثالثة على 200 ميكرولتر؛ ماصة دقيقة p1000 مضبوطة على 450 ميكرولتر ومضبوطا p2 على 2 ميكرولتر. بالنسبة للماصات الزجاجية المستخدمة لنقل الأجنة من أطباق بتري إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، قم بتمرير طرف الماصة بسرعة عبر اللهب لتنعيم الحواف حتى لا تتلف الأجنة عند سحبها إلى الماصة.

< p class = "jove_title" >4. معالجة الأجنة لكروماتوغرافيا الغاز الفضائي للرأس

ملاحظة: يتم التعامل مع كل من الأجنة في المشيمات وتلك التي تمت إزالتها مسبقا من المشيمات الخاصة بهم بنفس الطريقة من أجل الاتساق في حساب عوامل التخفيف.

1. باستخدام ماصتين p200 مضبوطتين على 50 ميكرولتر ، اسحب 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل البروتياز في واحد واسحب 50 ميكرولتر من الماء في الثانية.
2. باستخدام الماصة الزجاجية والماصة الدقيقة ، ضع بسرعة 10 أجنة (من الخطوة 2.2) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وأغلق الغطاء (كما هو موضح في الشكل 2 أ). كرر ذلك لجميع العينات المراد اختبارها ، والضوابط ، والأجنة المعالجة بالإيثانول.
3. باستخدام الماصة الدقيقة p200 المضبوطة على 200 ميكرولتر ، افتح الغطاء بسرعة وقم بإزالة جميع وسائط الأجنة المتبقية (كما هو موضح في الشكل 2C). ضع الماصة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من الماء بسرعة في الأنبوب وقم بإضافتها بسرعة ولكن برفق (حتى لا تتلف الأجنة) ثم قم بإزالة الماء. أضف بسرعة 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل البروتياز من الماصة المنتظرة وأغلق غطاء الأنبوب (الشكل 2 د).
   ملاحظه: قم بإجراء هذه العملية عينة واحدة في كل مرة.
4. دع العينة تجلس في RT لمدة 10 دقائق للسماح لكوكتيل البروتياز بتحلل المشيمة. ثم أضف بسرعة 450 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وأغلق غطاء الأنبوب (الشكل 2E). دوامة العينات لمدة 10 دقائق. لتسريع العملية ، قم بإعداد الخلاط لدوامة عينات متعددة في نفس الوقت.
   ملاحظة: أضف كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من خليط حبة السيليكا (حجمان ، حبة 0.5 مم و 1 مم) إلى أي أنبوب به أجنة أكبر من 24 حصان. في الأجنة الأكبر سنا ، سيبقى الحبل الظهري سليما بغض النظر عن مدة تجانسها.
5. بعد التجانس لمدة 10 دقائق ، قم بإزالة 2 ميكرولتر من المادة المطفية للجنين المتجانس بسرعة وأضفها إلى قارورة كروماتوجراف الغاز. أغلق القارورة بسرعة بغطاء بولي تترافلورو إيثيلين.

5. إعداد معايير الوسائط والإيثانول

1. لإعداد معايير الوسائط ، قم بتخفيف الوسائط بمعامل 10 باستخدام محلول كوكتيل 5 M NaCl / البروتياز. أضف 2 ميكرولتر من كل عينة إلى قارورة كروماتوجراف الغاز وأغلقها بغطاء بولي تترافلورو إيثيلين.
2. لتحضير معايير الإيثانول ، قم بإنشاء تخفيف تسلسلي للإيثانول بنسبة 100٪ في محلول كوكتيل 5 M كلوريد الصوديوم / البروتياز بالتركيزات التالية: 0.3125 ، 0.625 ، 1.25 ، 2.5 ، 5 ، 10 ، 20 ، و 40 مليمتر. أضف 2 ميكرولتر من كل معيار إلى قارورة كروماتوجراف الغاز وأغلقها بغطاء بولي تترافلورو إيثيلين.

< ص الفئة = "jove_title" >6. تحضير كروماتوغرافيا الغاز الفضائية للرأس

ملاحظة: يستخدم كروماتوغرافيا غاز الفضاء للرأس لتحديد مستويات الإيثانول ، وليس للفصل.

1. اضبط سخان جهاز أخذ العينات التلقائي على 58 درجة مئوية وقم بتشغيله. اسمح للسخان بالوصول إلى 58 درجة مئوية ، وقم بتشغيل خطوط الهواء وغاز الهيدروجين التي تغذي كروماتوجراف الغاز (لتأين اللهب المستخدم لتحديد كمية الإيثانول).
   ملاحظة: يجب ضبط psi لتشغيل الكروماتوجراف بشكل صحيح وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. تأكد من تشغيل خط الهيليوم واضبطه على psi المناسب.
2. بالنسبة للحاجز ، تأكد من أن عدد العينات المحقونة ليس >100. بالنسبة لألياف الحقن ، تأكد من أن عدد العينات المحقونة ليس >500.
   ملاحظة: إذا كان أي منهما يزيد عن كمية الحقن ، فستحتاج إلى تغييرها قبل إجراء عينات الاختبار.
3. قم بتشغيل برنامج التحليل وتأكد من إعداد محطة العمل بشكل صحيح. تخزين جميع البيانات وفقا لمعايير المختبر / القسم. قم بإنشاء قائمة عينة جديدة للنماذج المراد تشغيلها.
4. ابدأ طريقة بدء التشغيل وانتظر حتى يستقر كاشف تأين اللهب قبل تشغيل العينات. بمجرد الاستقرار ، قم بتشغيل طريقة بدء تشغيل البرنامج لتنظيف الألياف.

< p class = "jove_title" >7. عينة قياسات باستخدام كروماتوغرافيا الغاز الفضائي للرأس

1. بمجرد اكتمال طريقة بدء التشغيل، قم بإنشاء سطر جديد واحد لكل عينة في قائمة العينات. من قائمة الطرق في برنامج التحليل ، قم بتحميل 436 الإيثانول الحالي spme 2013 3 دقائق تمتص 2_5min تشغيل rg. الميثامفيتامين لكل عينة في قائمة العينات.
   1. املأ قائمة العينات ، بدءا من الهواء والماء و 5 أمتار كوكتيل كلوريد الصوديوم / البروتياز الفراغي. ثم أدخل المعايير بالترتيب ، من 0.3125 إلى 40 مليمتر. اتبع المعايير مع جولة ثانية من فراغات كوكتيل الهواء والماء و 5 M NaCl / protease.
   2. أدخل جميع عينات الطاف الجنينية المتجانسة ليتم اختبارها ، من أدنى إلى أعلى تركيز متوقع للإيثانول. انتهي بالدخول في جولة ثالثة وأخيرة من فراغات كوكتيل الهواء والماء و 5 M NaCl / protease.
2. أضف قوارير كروماتوجراف الغاز إلى جهاز أخذ العينات الآلي بالترتيب الذي تم إدخال العينات به. اترك العينات تسخن لمدة 10-15 دقيقة. ابدأ تشغيل العينة في البرنامج.
3. بعد تشغيل جميع العينات والفراغات النهائية، قم بتنشيط طريقة إيقاف التشغيل في البرنامج عن طريق إضافة عينة نهائية في قائمة العينات وتشغيل وضع الاستعداد. ميث. قم بعمل نسخة احتياطية من جميع البيانات التي تم الحصول عليها أثناء عمليات تشغيل العينة. قم بإيقاف تشغيل الجهاز بالترتيب التالي: سخان أخذ العينات الأوتوماتيكي ، وخزان الهيدروجين ، وفقط بعد أن تصل درجة حرارة الكروماتوجراف إلى 30 درجة مئوية ، خزان الهواء. اترك خزان الهيليوم مفتوحا للحفاظ على عمود الشمع.

< p class = "jove_title" >8. نموذج تكامل ذروة الإيثانول وتحليل تركيز العينة

ملاحظة: تم حساب جميع القيم من 8.3 فصاعدا في ملف Excel تم تعبئته مسبقا جميع المعادلات.

1. بمجرد اكتمال طريقة إيقاف التشغيل ، انقر فوق فتح مخطط كروماتو. افتح المجلد الذي يحتوي على النتائج. يتم دمج العينات تلقائيا في هذا البرنامج.
2. في النتائج ، تأكد من دمج القمم الصحيحة (قمم الإيثانول بين 2 و 2.5). بمجرد تأكيد جميع العينات، اطبع النتائج أو قم بتصديرها.
3. ارسم ذروة ارتفاع معايير الإيثانول على رسم بياني. احسب قيم المنحدر وتقاطع Y و R² لمعايير الإيثانول (يجب أن يكون R² >0.99).
   ملاحظه: سيتم استخدام هذه القيم لتحديد تركيز الإيثانول من ارتفاع ذروة العينة.
4. لكل عينة ، اطرح ذروة ارتفاع العينة من تقاطع Y لمعايير الإيثانول. اقسم هذه القيمة على ميل معايير الإيثانول للحصول على قيمة الإيثانول لكل عينة في قوارير GC.
   
5. لحساب تركيز الإيثانول في الأجنة ، احسب أولا عامل التخفيف لكل عينة. خذ مقياس الحجم المحسوب في الخطوة 1.3 من هذا البروتوكول وقسمه على مقياس الحجم زائد 500 ميكرولتر. يمثل هذا محلول كوكتيل كلوريد الصوديوم / البروتياز 5 M المضاف إلى كل عينة أثناء معالجة الأجنة (الخطوتان 4.3 و 4.4).
   
6. باستخدام عامل تخفيف العينة هذا ، اضرب في قيمة الإيثانول العينة لكل عينة. ستكون النتائج بتركيز مللي مولار. احسب العينات المرجعية للوسائط بضرب قيمة الإيثانول للوسائط في عامل التخفيف 10.
   
   

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: صورة لجنين بعد 24 ساعة من الإخصاب (HPF) داخل المشيمة. الجنين وصفار البيض محاط بسائل خارج الجنين ، وكلها تقع داخل المشيمة.

< p class = "jove_content" >
الشكل 2: بروتوكول لقياس الحجم الجنيني ومعالجة الأجنة لتحليلها. (أ) تم نقل عشرة أجنة بقوة 24 HPF إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل تم وضع علامة عليه بحج...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جهاز أخذ العينات التلقائي، CP-8400 فاريان جهاز أخذ العينات الآلي للكروماتوجراف الغازي ايثانول مختبرات ديكون 2701 قارورة كروماتوجراف الغاز مع حاجز بولي تترافلورو إيثيلين / سيليكون وغطاء بلاستيكي 2 مل رشيق 8010-0198 يمكن إعادة استخدام القوارير بعد التنظيف ، ولكن ليس الأغطية / الحاجز كروماتوجراف الغاز ، CP-3800 فاريان هيليوم مقدمة بموجب عقد للجامعة العمود الشعري HP Innowax رشيق 19095N-123I 30 م × 0.53 مم × 1.0 ميكرومتر سمك الفيلم هيدروجين مقدمة بموجب عقد للجامعة أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل فيشر ساينتيك 2682002 أطراف الماصات الدقيقة 10 ميكرولتر فيشر ساينتيك 13611106 أطراف الماصات الدقيقة 1000 ميكرولتر فيشر ساينتيك 13611127 أطراف الماصات الدقيقة 200 ميكرولتر فيشر ساينتيك 13611112 Pipetman L p1000L ماصة دقيقة جيلسون FA10006M Pipetman L p200L ماصة دقيقة جيلسون FA10005M Pipetman L p2L ماصة دقيقة جيلسون FA10001M بولي تترافلورو إيثيلين / سيليكون الحاجز وغطاء بلاستيكي رشيق 5190-7021 أغطية بديلة / حواجز لقوارير كروماتوغراف الغاز تجميع ألياف الاستخراج الدقيق للمرحلة الصلبة Carboxen / Polydimethylsiloxane ميليبور سيجما 57343-U ألياف بديلة محطة عمل كروماتوغرافيا النجوم فاريان برامج الكروماتوغرافيا Thermogreen منخفض النزيف (LB-2) الحاجز ميليبور سيجما هاتف: 23154 استبدال حاجز المدخل