الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق: تقنية فصل غير متغيرة للطبيعة لتحليل مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا السليمة

الملخص

المصدر: Konovalova، S. تحليل مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخلايا البشرية المستنبتة باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق والنشاف المناعي. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية كهربائية ، تسمى الصفحة الزرقاء الأصلية ، لتحليل مجمعات بروتين الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في حالتها المطوية أصلا والنشطة وظيفيا. تتسبب صبغة Coomassie الزرقاء الأنيونية في أن تصبح مجمعات البروتين سالبة الشحنة ، مما يسمح بالفصل بناء على الحجم والهيكل.

البروتوكول

1. تحضير المخازن المؤقتة والحلول

ملاحظة: يتم تلخيص جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1. الأحجام المحددة للمخازن المؤقتة كافية لإعداد وتشغيل 10 عينات. يمكن تخزين جميع المخازن المؤقتة عند +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.

1. تحضير 20 مل من 3x هلام يحتوي على 1.5 M حمض أمينوكابرويك ، 150 ملي مبل بيس تريس في الماء المقطر (dH₂O). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0.
2. تحضير 10 مل من 2 M حمض الأمينوكابرويك في dH₂O.
3. قم بإعداد 1 مل من المخزن المؤقت للميتوكوندريا عن طريق الجمع بين ما يلي: 0.5 مل من 3x Gel Buffer و 0.5 مل من 2 M aminocaproic acid و 4 μL من 500 ملي EDTA.
4. قم بإعداد 1,000 مل من المخزن المؤقت للكاثود الذي يحتوي على 15 ملي مولار من Bis-tris و 50 ملي مولار من tricine في dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0.
   1. قم بإعداد 200 مل من المخزن المؤقت للكاثود الأزرق عن طريق إضافة 0.04 جم من Coomassie blue G-250 إلى 200 مل من المخزن المؤقت للكاثود.
5. قم بإعداد 1,000 مل من المخزن المؤقت للأنود الذي يحتوي على 50 ملي ملي Bis-tris في dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0.
6. تحضير 2.5 مل من عينة عازلة تحتوي على 750 ملي مولار حمض أمينوكابرويك و 5٪ كوماسي الأزرق G-250 في الحمض_{الهيدروجيني 2}O.

< p class = "jove_title" >2. تحضير محللات الميتوكوندريا

1. ضع الزنازين في اليوم السابق للجمع. بالنسبة لخلايا HEK293 أو 143B ، استخدم وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ L-glutamine ، و 100 مجم / مل بنسلين و 100 مجم / مل من الستربتومايسين. قم بزراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند +37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. تأكد من وجود ما لا يقل عن 500,000 خلية لكل عينة في يوم الجمع.
2. اغسل الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام PBS المثلج. تجنب فصل الخلايا عن اللوحة. اكشط الخلايا وحبيبها عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية.
3. اغسل حبيبات الخلية مرتين باستخدام PBS المثلج ، وجهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 2.2. قم بقياس تركيز البروتين بطريقة برادفورد باستخدام مجموعة تجارية. حبيبات الخلايا عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية.
   ملاحظه: بعد تجميع الخلايا ، قم بتنفيذ جميع الخطوات عند +4 درجة مئوية ولا تقم بالدوامة.
4. تحضير 20 مل من PBS مع مثبط البروتياز عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من مثبط الإنزيم البروتيني 100x إلى 20 مل من PBS. ابق على الجليد. أعد تعليق الخلايا في PBS مع مثبط الإنزيم البروتيني إلى تركيز البروتين النهائي البالغ 5 مجم / مل.
   1. لحساب حجم PBS مع مثبط الإنزيم البروتيني اللازم لإعادة تعليق الخلايا عند 5 مجم / مل ، احسب كمية البروتين في كل عينة. لهذا الحساب ، استخدم تركيز البروتين المقاس في الخطوة 2.3 وحجم PBS المستخدم لإعادة تعليق الخلايا بعد الغسيل في الخطوة 2.3.
5. تحضير 1 مل من 3.3 ملي ديجيتونين في PBS مع مثبط البروتين. أضف 3.3 ملي ديجيتونين إلى التركيز النهائي البالغ 1.65 مليمتر. تخلط جيدا وتحتضن على الثلج لمدة 5 دقائق.
   1. لتحضير 1 مل من 3.3 ملي مولار من الديجيتونين في PBS مع مثبط البروتياز ، قم بإذابة 4 مجم من الديجيتونين في 1 مل من PBS عند 100 درجة مئوية حتى لا يظهر أي راسب ويبرد على الجليد على الفور. أضف 10 ميكرولتر من مثبط الإنزيم البروتيني 100x إلى 1 مل من محلول الديجيتونين.
      ملاحظه: استخدم فقط محلولا جديدا من digitonin.
      أنذر: الديجيتونين سام! استخدم قناع الوجه والقفازات ومعطف المختبر.
6. أضف PBS مع مثبط البروتيناز (المحضر في الخطوة 2.4) إلى الحجم النهائي البالغ 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية. في هذه الخطوة ، يتم تكوير الميتوكوندريا.
7. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في عازلة الميتوكوندريا. حجم المخزن المؤقت للميتوكوندريا هو نصف حجم PBS في الخطوة 2.4.
8. تحضير لوريل مالتوسيد طازج بنسبة 10٪ في PBS يحتوي على مثبط البروتياز (محضر في الخطوة 2.4). 1 مل يكفي ل 10 عينات. أضف 10٪ لوريل مالتوسيد إلى التركيز النهائي البالغ 1٪. احتضن على الثلج لمدة 15 دقيقة (يمكن أن تكون هذه الخطوة أطول حتى ساعتين).
9. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند +4 درجة مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد. قم بقياس تركيز البروتين بطريقة برادفورد باستخدام مجموعة. أضف المخزن المؤقت للعينة ، وهو حجم يمثل نصف حجم لوريل مالتوسيد المستخدم في الخطوة 2.8. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

< p class = "jove_title" >3. تحضير هلام التدرج ل BN-PAGE

1. صب جل التدرج ل BN-PAGE في درجة حرارة الغرفة. ضع صانع التدرج على لوح تحريك وقم بتوصيله بأنبوب مرن بالمضخة التمعجية. قم بإرفاق مجموعة التسريب بالإبرة بالأنبوب. ضع أداة تقليب مغناطيسية في الغرفة القريبة لصانع التدرج. اغسل الأنبوب ب dH₂O بأقصى سرعة للمضخة لمدة 10 دقائق.
2. أفرغ الأنبوب وصانع التدرج. استخدم ماصة لإزالة أي بقايا dH₂O في القناة بين غرف صانع التدرج. أغلق القناة والأنبوب بالصمام.
3. باستخدام إطار الصب والمشابك ، قم بتجميع لوحين زجاجيين في الحامل ، والذي يحتوي على ثقب في الأسفل ، وضعه على الحامل. تأكد من أنه أكثر أو أقل على سطح مستقيم مع توازن مائي. ضع الإبرة المتصلة بالأنبوب بين الألواح الزجاجية.
4. تحضير محاليل هلام 6٪ و 15٪ (الجدول 2). ابق على الجليد. أضف بيرسلفات الأمونيوم (APS) وتراميثيلين ثنائي الأمين (TEMED) (يبدأون البلمرة) أخيرا. تخلط برفق لتجنب تكوين فقاعات الهواء.
5. قم بتحميل الطرف القريب من غرفة أنابيب خلاط الهلام المتدرج مع 6٪ هلام والطرف البعيد مع 15٪ هلام. يجب أن يكون الحجم الكلي للهلام مساويا لحجم الجل الفاصل بين الألواح الزجاجية. وبالتالي ، استخدم 2.6 مل من الجل 6٪ و 2.1 مل من الجل بنسبة 15٪ في خلاط الجل المتدرج لجل واحد بحجم 8.3 سم × 7.3 سم.
6. قم بتشغيل النمام المغناطيسي ، وافتح الأنبوب والقناة بين غرف صانع التدرج. قم بتشغيل المضخة التمعجية على الفور إلى 5 مل / دقيقة. املأ الألواح الزجاجية ، ولا تسمح للفقاعات بالدخول إلى الجل. قم بإزالة الإبرة في حالة عدم وجود هلام في الأنبوب.
7. قم بتراكب الجل برفق مع dH₂O. احتفظ بالجل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل للبلمرة.
8. مباشرة بعد صب الجل ، اغسل الأنبوب عن طريق ملء غرف التدرج ب dH₂O واستخدام المضخة التمعجية بأقصى سرعة. عند تحضير اثنين وأكثر من المواد الهلامية ، قم دائما بتنظيف النظام بينهما.
9. قم بإعداد 1x جل عازل عن طريق خلط 3 مل من 3x gel buffer وإضافة 6 مل من dH₂O. قم بإزالة dH₂O من سطح الجل بورق ترشيح برفق. اغسل سطح الجل بمحلول جل 1x. قم بإزالة 1x جل المخزن المؤقت بورق الترشيح برفق.
   1. تجنب الألياف من ورق الترشيح الموجود على الجل. لضمان ذلك ، قم بقص الورق إلى قطع صغيرة بالمقص ، لكن لا تمزق الورق.
10. ضع المشط بين الألواح الزجاجية ، لكن لا تغمره بالكامل لتتمكن من صب جل التكديس تحت المشط. تحضير جل التراص بنسبة 4٪ (الجدول 2). أضف APS و TEMED أخيرا عندما يبدأون البلمرة بسهولة. امزج بلطف مع تجنب فقاعات الهواء.
11. قم بتراكب جل التكديس ، وتجنب الفقاعات تحت المشط ، واغمر المشط بالكامل. دع جل التكديس يتبلمر لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بإزالة المشط واغسل الآبار باستخدام 1x هلام عازل باستخدام ماصة.
    1. بعد البلمرة ، يمكن تخزين الجل عند +4 درجة مئوية لبضعة أيام. لتخزين الجل ، لف الجل بورق مبلل ب dH₂O وغشاء بلاستيكي لمنع جفاف الجل.

< p class = "jove_title" >4. الرحلان الكهربائي للهلام الأزرق الأصلي

ملاحظة: لمنع تدهور مجمعات OXPHOS ، قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند +4 درجة مئوية. استخدم المخازن المؤقتة المبردة مسبقا.

1. قم بتحميل كاسيت الجل بمخزن الكاثود الأزرق حتى قاع الآبار. يكون تحميل العينات أسهل عندما لا يتم ملء الكاسيت إلى الأعلى. اغسل الآبار بمحلول الكاثود الأزرق ثم املأ الآبار بمخزن الكاثود الأزرق باستخدام الماصة.
2. قم بتحميل العينات (5-30 ميكروغرام من البروتين) في الآبار. املأ كاسيت الجل برفق إلى الأعلى بمخزن الكاثود الأزرق والخزان بمخزن أنود.
3. قم بتشغيل الجل لمدة 15 دقيقة بجهد ثابت يبلغ 40 فولت. ثم قم بزيادة الجهد إلى 80 فولت (أو استخدم تيارا ثابتا يبلغ 6 مللي أمبير) ، ولا تتجاوز 10 مللي أمبير. قم بتشغيل الجل حتى تصل الصبغة إلى 2/3 من طول الجل.
4. استبدل المخزن المؤقت للكاثود الأزرق بمخزن مؤقت للكاثود واستمر في الرحلان الكهربائي حتى تنفد واجهة الصبغة. في المجموع ، يستغرق الرحلان الكهربائي حوالي 3 ساعات.
5. استرجع الألواح الزجاجية وانقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) عن طريق النشاف شبه الجاف.

النتائج

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة ل BN-PAGE

المخزن المؤقت أو الحل تكوين وصفة 3 × المخزن المؤقت للهلام 1.5 م حمض أمينوكابرويك 3.94 غرام من حمض الأمينوكابرويك 150 ملي مبل بيس تريس 0.63 غرام من...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألواح خلية 100 مم ثيرمو فيشر العلمي 130182 40٪ أكريلاميد / مكرر 37.5: 1 بيو راد 161-0148 حمض أمينوكابرويك سيغما أ 2504 بيرسلفات الأمونيوم سيغما أ 3678 بيس تريس سيغما ب 7535 مجموعة فحص بروتين برادفورد بيورراد 5000006 كاشطات الخلية صياد 11597692 كوماسي بلو G250 (سيرفا بلو جي) سيرفا 35050 ديجيتونين سيغما د141 DMEM لونزا 12-614F / 12 EDTA تقنيات الحياة هاتف: 15575-038 FBS تقنيات الحياة 10270106 مصل الأبقار الجنينية تقنيات الحياة 10270106 الجلسرين سيغما جي 5516 صانع التدرج بيو راد 1654120 لوريل مالتوسيد (ن-دوديسيل β-د-مالتوسيد) سيغما د4641 ل-جلوتامين تقنيات الحياة 25030024 ل-جلوتامين جيبكو هاتف 25030 N ، N ، N ′ ، N ′ - TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED) سيغما تي 9281 برنامج تلفزيوني تقنيات الحياة BE17-516F البنسلين / الستربتومايسين لونزا 17-602 [إ] البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140 مزود الطاقة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية ربحية السهم 301 مثبطات الإنزيم البروتيني الترمو: العلمية 10137963 ترانس بلوت توربو ميني PVDF بيورراد 1704156 تريسين سيغما تي 9784 التربسين EDTA جيبكو 15400054 جهاز الرحلان الكهربائي العمودي بيورراد 1658004