مقالة منهجية

تطبيق الربط الدائم الشريان المخي الأوسط في الماوس

DOI:

10.3791/3039

⸱

يوليو 25, 2011

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, 2Department of Neurology, University of Alabama at Birmingham, 3Departments of Anesthesiology, Pharmacology and Physiology, University of Rochester

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشريان المخي الأوسط (MCA) هي تقنية ربط لدراسة نقص التروية الدماغية التنسيق في النماذج الحيوانية. في هذه الطريقة ، يتعرض الشريان الدماغي الأوسط والتي حج القحف ligated بواسطة الكي. هذا الأسلوب يعطي كميات احتشاء استنساخه عالية وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة مقارنة مع الوسائل الأخرى المتاحة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقص تروية الدماغ هو التنسيق بين النوع الاكثر شيوعا من السكتات الدماغية المشاهدة في المرضى. نظرا لأهمية سريرية كان هناك جهد لفترات طويلة لتطوير نماذج حيوانية مناسبة لدراسة الأحداث التي تتكشف خلال إهانة الدماغية. وتشمل هذه التقنيات عابرة أو دائمة ، ونماذج عالمية إقفار تنسيق أو باستخدام العديد من نماذج حيوانية مختلفة ، مع القوارض أكثرها شيوعا.

يتم استخدام أسلوب الربط الدائم MCA الذي يشار إليه أيضا باسم pMCAo في الأدب على نطاق واسع كنموذج الإسكيمية التنسيق في القوارض 1-6. وقد وصفت هذه الطريقة في الأصل للفئران بواسطة تامورا وآخرون. في عام 1981 7. في هذا البروتوكول استخدمت للوصول إلى حج القحف والمغطي للMCA والمناطق القريبة التي تخثير كهربي. عوائق في إشراك المناطق القشرية ومعظمهم من مخططي أحيانا اعتمادا على موقع الانسداد. الآن هذه التقنية راسخة واستخدامها في العديد من المختبرات 8-13. وقد أدى استخدامها في وقت مبكر من هذه التقنية لتعريف ووصف "الأساسية احتشاء" و "شبه الظل" 14-16 ، وغالبا ما يستخدم لتقييم المركبات المحتملة اعصاب 10 ، 12 ، 13 ، 17. على الرغم من إجراء الدراسات الأولية على الفئران ، وقد استخدمت بنجاح ربط دائم MCA في الفئران مع تعديلات طفيفة 18-20.

هذا النموذج غلة عوائق استنساخه وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد. حوالي 80 ٪ من الجلطات يحدث في البشر في منطقة MCA 21 وبالتالي هذا هو نموذج مهم جدا للدراسات السكتة الدماغية. حاليا ، هناك قلة من العلاجات الفعالة المتاحة لمرضى السكتة الدماغية ، وبالتالي هناك حاجة لنماذج جيدة لاختبار المركبات الدوائية المحتملة وتقييم النتائج الفسيولوجية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لدراسة الخلايا آليات الاستجابة نقص الأكسجين في الجسم الحي.

هنا ، فإننا نقدم لجراحة ربط MCA في ماوس C57/BL6. وصفنا إعداد ما قبل الجراحة ، جراحة ربط MCA و2،3،5 Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) لتلطيخ الكمي لحجم احتشاء.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة جامعة روتشستر المكرسة لاستخدام الأخلاقية للحيوانات في مجال البحوث (UCAR). وينبغي اتباع تقنيات العقيم خلال البروتوكول. ويتطلب استخدام قفازات معقمة وقناع.

يتم وصف كل المعدات والمواد والمواد الكيميائية ، والأدوات التي يتم استخدامها أثناء البروتوكول في الجدول 1.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. حقن الفئران تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.05mg/kg) 2 ح قبل الجراحة ، وذلك مباشرة بعد الجراحة وبعد ذلك كل 3-5 ساعات خلال فترة ال 24 الأولى بعد الجراحة ح.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، والإسفنج شاش ، وتطبيقها من قبل طرف القطن الأوتوكلاف. إبقاء الأدوات الجراحية في الايثانول 70 ٪ خلال الجراحة والهواء الجاف على شاش معقم الحق قبل الاستخدام. رذاذ مجال العمل مع الايثانول 70 ٪.
  3. تخدير الماوس مع 3 ٪ isofluorane - 20 ٪ خليط غاز الأكسجين باستخدام المرذاذ مخدر. ضبط كمية الأوكسجين مع تدفق متر. اختبار مستوى التخدير بواسطة إصبع أو معسر الذيل (أنها ينبغي أن لا تستجيب). المحافظة على مستوى التخدير مع 2 ٪ (V / V) isofluorane.
  4. تطبيق الدموع الاصطناعية لعيون الماوس ، وتوخي الحذر لتجنب إتلاف العين أثناء العملية الجراحية. ضع الماوس على جانبها الصواب في موقف الأطراف.
  5. حلق في منطقة تقع على الجانب الأيسر بين العين اليمنى وقاعدة الأذن اليسرى باستخدام كليبرز الحيوانية. تطهير المنطقة من قبل بالتناوب بين حل betadine والايثانول 70 ٪ باستخدام تطبيقها غيض القطن وفرك طفيفة في المنطقة. كرر حسب الضرورة.
  6. ضع الماوس على لوحة التدفئة متصلة التحقيق المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. إدراج التحقيق المستقيم باستخدام الزيوت المعدنية.
  7. موقف الماوس على جانبها الأيسر تحت المجهر وآمنة مع الشريط. قطع الاسفنج في إطار والشاش ، وتغطي منطقة العمليات الجراحية.

2. الجراحية الإجرائية وربط MCA

  1. جعل شق عمودي بين العين اليمنى وقاعدة الأذن اليسرى باستخدام مقص غرامة على التوالي. استخدام المرقأة المنحني للحفاظ على المنطقة الجراحية المفتوحة.
  2. إجراء شق أفقي على العضلات الزمنية باستخدام مقص الربيع وفصل قليلا من العضلات الزمنية الجمجمة عن طريق سحب ببطء مع ملقط.
  3. جعل حج القحف صغيرة تحت الصدغ عند تقاطع القوس الوجنية صدفي والعظام باستخدام إبرة 18G حين عقد عظم الفك مع ملقط منحنية.
  4. فضح MCA عن طريق إزالة قطعة صغيرة من عظم الجمجمة مع rongeurs. لا ينبغي أن القوس الوجنية ومحتويات المدارية للتلف خلال هذه العملية. إذا كان الإفراط في تجفيف الأنسجة يحدث خلال هذه العملية ، وتطبيق برنامج تلفزيوني العقيمة مع تطبيقها غيض من القطن.
  5. Ligate الجزء الأعلى من MCA باستخدام cauterizer سفينة صغيرة.
  6. مكان العضلات الزمنية مرة أخرى إلى مكانها الأصلي وإغلاق موقع شق جراحي مع خيوط النايلون 5-0.
  7. وقف وإزالة التخدير التحقيق المستقيم. حقن الفأر مع جرعة من 2 البوبرينورفين (0.05mg/kg) تحت الجلد. عودة الماوس إلى القفص الذي كان يحتفظ بها في 37 درجة مئوية مع لوحة التدفئة.
  8. ترصد عن كثب الماوس ل24 ساعة المقبلة عن أي إزعاج (قلة الشهية / استهلاك المياه ، وموقف منحنية ، والتنفس المتزايدة ، الشعرية ، التي اقيمت الشعر). حقن تحت الجلد البوبرينورفين الفأر مع كل ح 3-5 بعد الجراحة حتى 24H. تزويد الفأر مع هلام الانتعاش خلال هذه الفترة.

3. TTC تلطيخ وتحديد حجم السكتة الدماغية

  1. أربع وعشرين ساعة بعد الجراحة تخدير عميق الماوس ، يروي transcardially الماوس مع TTC 4 ٪ (W / V) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 15 دقيقة ثم مع حل بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 10 دقيقة باستخدام مضخة صغيرة تحوي على معدل التدفق المتوسط. إزالة المخ ووضعه في حل بارافورمالدهيد 4 ٪ بين عشية وضحاها.
  2. موقف الدماغ إلى كتلة sectioning. شريحة الدماغ إلى شرائح سميكة 1MM باستخدام شفرات الحلاقة.
  3. مكان شرائح المقبل لحاكم النطاق ملليمتر. صورة شرائح باستخدام كاميرا رقمية متصلة مجهر تشريح.
  4. حساب مساحة السكتة الدماغية عن طريق طرح منطقة غير احتشاء للموقع المماثل من المساحة الكلية للموقع المقابل باستخدام صورة J البرمجيات (http://rsbweb.nih.gov/ij/). حساب حجم السكتة الدماغية عن طريق التراص منطقة السكتة الدماغية من شرائح 22.

4. توجيهات لاستخدام صورة برنامج J

  1. فتح ملف الصورة التي سيتم تحليلها في مجال البرمجيات J صورة عن طريق النقر على القائمة ملف.
  2. انقر على علامة التبويب "خط مستقيم" في البرنامج. رسم خط مستقيم بين الهوامش اثنين على المسطرة. انقر على القائمة "تحليل" وحدد "تعيين النطاق. تعيين المسافة المعروفة باسم 1 ، وحدة طول ملم.
  3. انقر فوق علامة التبويب "دائرة اليدوي. رسم الخطوط العريضة لدائرة نصف الكرة الأرضية المقابل. انقر على القائمة "تحليل" وحدد "قياس". سوف يطفو على السطح نافذة الحساب تظهر المنطقة من دائرة مرسومة.
  4. رسم دائرة أخرى في مختلف أنحاء الكرة الأرضية باستثناء منطقة المماثل (أبيض) السكتة الدماغية. قياس المساحة كما هو مبين في الخطوة 4.3. سيتم إضافة قيمة جديدة إلى إطار الحساب. الفرق بين 1 و 2 القيم يمثل منطقة احتشاء الذي يشار اليه على أنه ألف في الصيغة أدناه.
  5. حساب مساحة السكتة الدماغية في كل شريحة بتكرار الخطوات 4،2-4،4. تتخذ من منطقة الجمع السكتة الدماغية محسوب في كل شريحة (ΣA ن). وهذا يمثل حجم المخ معرفة حقيقة أن سمك كل شريحة من 1MM.
    ن خ ΣA 1MM (سمك كل شريحة) = حجم السكتة الدماغية

5. ممثل النتائج :

وعوائق التي حصلت عليها MCA ربط دائم في الماوس القشرية هي في الغالب. ومع ذلك ، فمن الممكن الحصول على الآفات تحت القشرية إذا ligated في MCA الأقرب إلى فرع العدسي. قد حجم المخ بعد ربط MCA تختلف من 10MM ل 35mm ³ ³ 19 و 23. وحدات التخزين مع احتساب ضربة تلطيخ TTC في Moyanova آخرون ما بين 19 ³ ³ 22mm و 10mm إلى حين تحديد حجم المخ من صور الرنين المغناطيسي في Filiano وآخرون ما بين 23 إلى ³ ³ 20mm 35mm. السبب المحتمل لهذه الاختلافات ربما يكون الموقع الدقيق للربط والأساليب المختلفة المستخدمة لقياس حجم المخ.

في الشكل 1 ، يظهر المخ ملطخة TTC 24 ساعة ظيفة دائمة MCA في ربط ماوس البرية C57/BL6 النوع. موقع السكتة الدماغية البيضاء في المظهر (الشكل 1A ، B). الشكل 1A وباء توضيح موقع احتشاء من زوايا مختلفة. ويبين الشكل 2 شرائح سميكة من 1MM الدماغ TTC الملون من السكتة الدماغية الأمامية إلى الخلفية (الشكل 2A - G). تم حساب حجم احتشاء 24 ساعة بعد الجراحة. حجم احتشاء هو ~ ³ 23mm.

figure-protocol-1
الشكل 1. تمثيل موقع السكتة الدماغية. AB ملون TTC صور الدماغ كله ، 24 ساعة بعد ربط MCA. المنطقة البيضاء يمثل احتشاء.

figure-protocol-2
الشكل 2. نتائج ممثلة (A G>) ، TTC الدماغ 1MM ملطخة أقسام ، 24 ساعة بعد MCAL. يتم محاذاة شرائح من الأمامي إلى الخلفي. المنطقة البيضاء يمثل احتشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وربط MCA دائمة الطريقة تعطي كميات احتشاء استنساخه عالية وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة مقارنة مع الوسائل الأخرى المتاحة. سهولة وخلال مدة قصيرة (~ 30 دقيقة) من إجراء جعلها أكثر عملية. ويستخدم على نطاق واسع في كل من الأسلوب الفئران والجرذان.

هذا الأسلوب يتطلب جراحة تحت stereomicroscope. ولذلك ، والخبرة في تشغيل تحت المجهر واتقان حج القحف الناجح هو ضروري. فمن الأفضل لوضع عوائق متسقة في المختبر قبل أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت الشركة في الأصل تقنية جراحية في مختبر الدكتور وليم هيل دال في كلية الطب في جورجيا. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر الدكتور ديفيد ألف Rempe Prifti واندا لاستخدام الكاميرا تشريح. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS041744 ، NS051279 ، NS064700 F31 و30815697D AHA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
NAME الشركة ورقم كتالوج
ألف حلول والكيماويات
محلول البوفيدون اليودي ، فرك الجراحية Aplicare ، 82-209
70 ٪ إيثانول Koptec ، V1001
2،3،5 كلوريد Triphenyltetrazolium (TTC) سيغما ، T8877
4 ٪ لامتصاص العرق علوم المجهر الإلكتروني ، 159SP
التخزين المؤقت الفوسفات المالحة ، ودرجة الحموضة : 7.4 أدلى ومعقمة في المختبر.
الزيوت المعدنية PML Microbiologicals ، R6570
Isofluorane شركة بتلر ، 029405
البوبرينورفين (0.3mg/ml) هوسبيرا ، NDC 0409-2012-32
دموع اصطناعية شركة بتلر ، 007312
جل الانتعاش واضح H 2 O ، 72-01-5022
باء المواد الجراحية والمعدات
C57/BL6 الماوس ، 10-12 أسابيع من العمر ولدت في مستعمرة في الحظيرة الجامعة
100 ٪ خزان الأوكسجين Airgas
مخدر مبخر وتدفق متر Surgivet ، الموديل 100
وسادة التدفئة مع دقق المستقيم أدوات العلوم الدقيقة ، TR200
تشريح المجهر زايس ، Stemi 2000
لوحة التدفئة بتكو للخدمات المحدودة 0307-013
سفينة صغيرة تعيين Cauterizer أدوات العلوم الدقيقة ، 18000-00
مضخة صغيرة تحوي جهاز هارفارد ، MPII
المحاقن 1ml دينار بحريني ، 329650
18G إبرة بيكتون ديكنسون ، 305196
خياطة جراحية 5.0 نايلون Ethilon ، 698H
Sectioning بلوك كينت العلمية و1MM
شفرات الحلاقة واحدة مستقيمة علوم المجهر الإلكتروني ، 71962
تسمية الشريط Scienceware ، بيل الفن منتجات F13463 - 2075
الشاش الإسفنج كيندال أمني دولي 2252 ، جونسون وجونسون 6415
القضبان الرفيعة القطن تلميح البروتستانتي 806 - WCL
C. أدوات الجراحة
ربيع مقص جراحي أدوات العلوم غرامة 15003-08
ملقط Microdissecting الزاوية أدوات العلوم غرامة 5 / 45
ملقط Microdissecting المنحني غرامة 5 تي أدوات العلوم
مقص غرامة على التوالي أدوات العلوم غرامة 14568-12
منحني مقراض العظم أدوات العلوم غرامة 16021-14
هارتمان المرقأة منحني أدوات العلوم غرامة 13003-10

الجدول 1. قائمة الأدوات والمواد والمواد الكيميائية المستخدمة لإجراء عملية ربط MCA. ألف حلول والكيماويات والمواد والمعدات الجراحية باء ، جيم أدوات الجراحة.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
  2. Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
  3. Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
  4. McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
  5. Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
  6. Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
  7. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  8. Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
  9. Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
  10. Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
  11. Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
  12. Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
  13. Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. , (2011).
  14. Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
  15. Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
  16. Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
  17. Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
  18. Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
  19. Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).
  20. Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
  21. O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).
  22. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  23. Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TTC

مقالات ذات صلة