مقايسة سحب الجزيء الواحد لتحليل فسفرة البروتين: تقنية إنتاجية عالية لتحديد فسفرة البروتين في محللة الخلية

Abstract

المصدر: Bailey، E. M. et al. ، مقايسة منسدلة أحادية الجزيء محسنة لتقدير كمية فسفرة البروتين. J. Vis. إكسب. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية قياس كمية حساسة لفسفرة البروتين باستخدام مقايسة منسدلة أحادية الجزيء. يزيد تشغيل البولي إيثيلين جلايكول البيوتين واستخدام الأجسام المضادة المصنفة من اكتشاف التيروزين الفسفوري بخصوصية.

Protocol

1. وظيفية المصفوفة بالجسم المضاد البيوتينيل

1. تحضير الحلول التالية.
   1. T50 Buffer ، محلول 10 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) و 50 ملي كلوريد الصوديوم. الحل مستقر لمدة 1 شهر في RT.
   2. T50-BSA عن طريق استكمال المخزن المؤقت T50 ب 0.1 مجم / مل من BSA. احتفظ بالمحلول المحضر على الجليد.
   3. 10 مجم / مل من بوروهيدريد الصوديوم (NaBH₄) في 1x PBS. قم بإعداد هذا مباشرة قبل الاستخدام.
   4. 0.2 مجم / مل من NeutrAvidin (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت T50.
      أنذر: NaBH₄ هو عامل اختزال وقابل للاشتعال. قم دائما بتطهير الحاوية بغاز النيتروجين بعد الاستخدام وتخزينها في مجفف.
2. قم بتشغيل المصفوفة باستخدام الجسم المضاد البيوتينيل.
   1. قم بإزالة المصفوفات الوظيفية PEG-biotin من الفريزر وقم بموازنة الأنبوب المخروطي مع RT قبل الفتح. ضع الغطاء مع توجيه المصفوفة لأعلى على طبق ثقافة أنسجة 100 مم (TC100) مبطن بغشاء مانع للتسرب (TC100><). ملاحظه: تقليل الإضاءة العلوية. يجب أن "تنتشر" جميع الحلول على المربعات التي تحددها المصفوفة الكارهة للماء. أضف حجما مناسبا من المحلول لتغطية كل مربع بالكامل (عادة 10-15 ميكرولتر) ولا تسمح للسائل بتجاوز المساحة المحددة. لإزالة السوائل بسرعة ، استخدم خط تفريغ داخلي متصل بقارورة تفريغ لالتقاط النفايات. اسمح ل NaBH₄ بالتفريغ لمدة ساعة واحدة قبل التخلص منها عن طريق ترك الأنبوب مفتوحا في غطاء الدخان الكيميائي. يعد علاج NaBH₄ ضروريا لتقليل التألق الذاتي في الخلفية ، وبالتالي تقليل اكتشافات الجزيء الفردي الإيجابي الكاذب.
   2. عالج كل مربع من المصفوفة ب 10 مجم / مل من NaBH₄ في 1x PBS لمدة 4 دقائق في RT. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS.
   3. احتضان كل مربع لمدة 5 دقائق مع 0.2 مجم / مل من NeutrAvidin في T50. يغسل ثلاث مرات باستخدام T50-BSA.
      ملاحظه: يرتبط NeutrAvidin ب PEG-biotin ويوفر موقعا ملزما للأجسام المضادة الحيوية.
   4. احتضان كل مربع لمدة 10 دقائق باستخدام 2 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد الخاص ب POI الحيوي في T50-BSA ؛ اغسل ثلاث مرات باستخدام T50-BSA.
      ملاحظه: يستخدم البروتوكول الحالي IgG المضاد للبيوتينيل (انظر جدول المواد) لالتقاط EGFR-GFP.

< p class = "jove_title" >2. SiMPull من POI من محللات الخلية الكاملة

ملاحظة: ضع طبق TC100 من مصفوفات SiMPull الوظيفية على الجليد لبقية تحضير SiMPull. هذه الخطوة هي سحب POI من محللة البروتين الكلي. يجب عدم إعادة استخدام المحللة بعد الذوبان.

1. تحضير الحلول التالية.
   1. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) / 0.1٪ جلوتارالديهايد (GA) في 1x PBS.
      أنذر: PFA و GA عبارة عن مثبتات كيميائية سامة ومواد مسرطنة محتملة. ارتد معدات الوقاية الشخصية. تخلص من المواد الكيميائية كنفايات خطرة وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية المحلية.
   2. تحضير 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.4.
2. قم بإذابة الثلج واخلطه عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. ابق على الجليد.
3. خفف 1 ميكرولتر من المحللة إلى 100 ميكرولتر مثلج T50-BSA / PPI.
   ملاحظه: إذا لزم الأمر ، حدد عامل التخفيف المناسب لمحاللة البروتين الكلي عن طريق تطبيق مجموعة من التخفيفات على المصفوفة. الكثافة المثلى لمستقبلات SiMPull لكل منطقة مصفوفة هي 0.04-0.08 / ميكرومتر².
4. احتضن المحللة على المصفوفة لمدة 10 دقائق ؛ ثم اغسلها أربع مرات باستخدام T50-BSA / PPI المثلج.
5. تمييع الجسم المضاد للفوسفوتيروزين المترافق AF647 (انظر جدول المواد) في T50-BSA / PPI المثلج البارد واحتضانه على المصفوفة لمدة 1 ساعة
   ملاحظه: في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام عموم مضاد ل pTyr (PY99) -AF647 IgG لتحديد السكان الفسفريين ل EGFR-GFP. يلغي استخدام الأجسام المضادة المصنفة مباشرة الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية ، مما يزيد من خيارات وضع العلامات ويحسن اتساق النتائج. يمكن الحصول على الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية من مصادر تجارية. إذا لم تكن متوفرة تجاريا ، فيمكن تصنيف الأجسام المضادة حسب الطلب باستخدام تقنيات الاقتران الحيوي القياسية ، وتتوفر مجموعات الاقتران الحيوي التجارية. يجب اختبار كل دفعة من الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت من أجل ظروف وضع العلامات المثلى عن طريق إجراء SiMPull لقياس منحنى الجرعة والعثور على نقطة التشبع.
6. يغسل ست مرات باستخدام T50-BSA المثلج لمدة 6-8 دقائق.
7. يغسل مرتين مع 1x PBS.
8. احتضان المصفوفة بمحلول 4٪ PFA / 0.1٪ GA لمدة 10 دقائق لمنع تفكك الأجسام المضادة.
9. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما بمقدار 10 ملي من Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 / PBS لتعطيل المثبتات.
   ملاحظه: بالنسبة للتجارب التي تستخدم أكثر من جسم مضاد واحد ، (على سبيل المثال ، اكتشاف مواقع متعددة للفوسفوتيروزين) ، كرر الخطوات 2.5-2.9.

3. الحصول على الصور

ملاحظة: يتم إجراء الحصول على صورة أحادية الجزيء باستخدام هدف TIRF 150x وفاصل الصور الذي يلتقط كل قناة طيفية في ربع معين من كاميرا emCCD (انظر جدول المواد). يتم الحصول على صور المعايرة أولا للسماح بتسجيل القناة ومعايرة كسب الكاميرا باستخدام شبكة محاذاة القناة ذات النمط النانوي (nanogrid) التي تحتوي على 20 × 20 مصفوفات من 200 ± 50 نانومتر ثقب على مسافة داخل الثقب تبلغ 3 ± 1 ميكرومتر (الحجم الإجمالي ~ 60 ميكرومتر × 60 ميكرومتر).

1. قم بإجراء تسجيل القناة باتباع الخطوات التالية.
   ملاحظه: ويلزم تسجيل دقيق للقناة لحساب التحديد المشترك للبواعث على النحو الصحيح. هذه الخطوة حاسمة.
   1. قم بتنظيف هدف الزيت وإيداع قطرة من الزيت على الهدف. ضع الشبكة النانوية على المسرح للتصوير. باستخدام الضوء الأبيض المرسل ، ركز على نمط الشبكة.
      ملاحظه: يتم الحصول على الصور باستخدام الشبكة النانوية باستخدام الضوء المنقول ، الذي يمر عبر الشبكة النانوية ويتم اكتشافه في جميع القنوات الطيفية. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام حبات متعددة الفلورسنت تنبعث منها مضان تم اكتشافه في كل قناة. يجب تحسين الحصول على الصور وفقا لكل إعداد مجهر.
   2. احصل على سلسلة من 20 صورة للشبكة. تأكد من أن وحدات البكسل غير مشبعة. احفظ سلسلة الصور ك "إيمانية".
   3. قم بإلغاء تركيز الشبكة النانوية لإنشاء نمط متجدد الهواء. احصل على سلسلة من 20 صورة لمعايرة الكسب. احفظ الصورة ك "كسب".
   4. احصل على سلسلة من 20 صورة لإزاحة الكاميرا عن طريق منع كل الضوء من الذهاب إلى الكاميرا. احفظ الصورة ك "خلفية".
2. الحصول على صور SiMPull.
   ملاحظه: قبل تصوير مصفوفة الغطاء ، استبدل حل Tris ب T50-BSA وقم بموازنة المصفوفة مع RT.
   1. قم بتنظيف هدف الزيت وإيداع زيت إضافي على الهدف. قم بتأمين مجموعة الغطاء على مرحلة المجهر.
   2. قم بتحسين قوة الإثارة لكل فلوروفور وزاوية TIRF ووقت تكامل الكاميرا. الهدف هو تحقيق أعلى إشارة إلى ضوضاء مع تقليل التبييض الضوئي للعينة. سجل قوة الليزر من أجل الاتساق في القياسات المستقبلية.
      ملاحظه: استخدمت الدراسة الحالية وقت التعريض 300 مللي ثانية للقناة الحمراء البعيدة و 1 ثانية للقناة الخضراء. تم استخدام ليزر 642 نانومتر بحوالي 500 ميكروواط من طاقة الليزر ، بينما تم استخدام ليزر 488 نانومتر عند 860 ميكروواط ، تم قياسه قبل عدسة الأنبوب.
   3. الحصول على صور لكل عينة. قم بتصوير القناة الحمراء البعيدة أولا ، متبوعا بكل فلوروفور بطول موجي منخفض لتقليل التبييض الضوئي. نظرا لانخفاض الحجم المستخدم لكل عينة ، تحقق من مستوى المخزن المؤقت كل 30-45 دقيقة وقم بتجديده حسب الحاجة.

Materials