مقايسة ثنائية الطبقة الدهنية المدعومة من المستوى: تقنية في المختبر تعتمد على الفحص المجهري للتحقيق في تجميع الستين على تقليد الأغشية البيولوجية

الملخص

المصدر: Curtis ، B. N. et al. إعادة تشكيل تجميع septin في الأغشية لدراسة الخصائص والوظائف الفيزيائية الحيوية. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء للتحقيق في تنظيم septin على طبقة ثنائية دهنية مدعومة بالزجاج في المختبر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. طبقات ثنائية الدهون المستوية

1. تنظيف البلازما للشرائح
   ملاحظه: يزيل تنظيف البلازما الملوثات العضوية ويزيد من ماء الزجاج ، مما يضمن امتصاص الدهون بكفاءة. قد تتغير الخطوات التالية أو تحتاج إلى تحسينها اعتمادا على منظف البلازما والأغطية الزجاجية المستخدمة.
   1. قم بتطهير منظف البلازما لمدة 5 دقائق بالأكسجين لإزالة الهواء من الخطوط والغرفة. هذا للتأكد من أنه عند تشغيل منظف البلازما ، يكون هناك أكسجين في المقام الأول في الخطوط والغرفة ، مما يوفر استعدادات ثنائية الطبقة أكثر اتساقا.
   2. أثناء التطهير ، قم ببث غاز خامل ، مثل N₂ أو Ar ، فوق الشرائح الزجاجية ذات الغطاء الصغير لإزالة الغبار والجسيمات.
      اختياري: يمكن غسل شرائح الغطاء الزجاجي عن طريق رش كل جانب بالأيزوبروبانول بنسبة 100٪ متبوعا بالماء. كرر غسل ماء الأيزوبروبانول 3 مرات ثم جفف بتيار N₂.
   3. رتب شرائح زجاجية ذات غطاء جاف في مهد من السيراميك. ضع المهد في الجزء الخلفي من حجرة البلازما بحيث تكون الغطاء موازية للحافة الطويلة للغرفة (وهذا يبقيها في مكانها أثناء تنظيف البلازما). قم بتشغيل منظف البلازما لمدة 15 دقيقة بالأكسجين بأقصى طاقة.
2. تحضير الغرفة
   ملاحظه: تستخدم الطريقة الموضحة هنا غرف محلية الصنع من أنابيب PCR البلاستيكية لدعم أحجام التفاعل ، ولكن قد تكون المواد الأخرى منخفضة الالتصاق ، مثل آبار السيليكون ، مناسبة أيضا.
   1. باستخدام شفرة حلاقة أو مقص ، قم بقطع الغطاء الموجود أسفل الجزء المتجمد مباشرة من أنبوب PCR سعة 0.2 مل (الشكل 1).
   2. قم بطلاء حافة أنبوب PCR بمادة لاصقة تعمل بالأشعة فوق البنفسجية ، وتجنب الجزء الداخلي من الأنبوب. ضع أنبوب PCR برفق في وسط غطاء نظيف بالبلازما.
      ملاحظه: لتجنب الغراء داخل الغرفة ، استخدم الحد الأدنى من الغراء للحصول على ختم ، وعالج على الفور بالأشعة فوق البنفسجية دون الاصطدام أو إزعاج الغرفة.
   3. ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي لمدة 5-7 دقائق لمعالجة المادة اللاصقة.
3. تشكيل ثنائي الطبقة
   ملاحظه: يجب استخدام سيارات الدفع الرباعي أحادية التشتت في هذه الخطوة لتكوين طبقة ثنائية بكفاءة. يقدم الجدول 1 وصفات لجميع المحاليل المؤقتة المستخدمة في تكوين الطبقة الثنائية ، بما في ذلك تركيزات المخزون والمخزن المؤقت النهائي.
   1. أضف 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم (SLBB: 300 ملي كلوريد كلوريد ، 20 ملي هيبس ، درجة الحموضة 7.4 ، 1 ملي مولار MgCl₂ ؛ الجدول 1) ، 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي 5 ملي مولار ، و 1 ميكرولتر من 100 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} إلى البئر. رج الغرف برفق من جانب إلى آخر لتعطيل سيارات الدفع الرباعي ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة < / > ملاحظه: للحد من التبخر ، احتضن في طبق بتري مغطى بمنديل مبلل.
4. غسل الدهون الزائدة
   ملاحظه: تزيل هذه الخطوة سيارات الدفع الرباعي الزائدة وتعمل كخطوة تبادل عازلة. من المهم جدا عدم كشط الطبقة الثنائية بطرف الماصة أثناء الغسيل ؛ إذا تعرض الزجاج ، فإن السيبتين والعديد من البروتينات الأخرى سوف ترتبط بشكل لا رجعة فيه ، مما يقلل من تركيز البروتين الفعال.
   1. بعد الحضانة ، اشطف الطبقة الثنائية 6x ب 150 ميكرولتر من SLBB ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل للخلط في كل مرة مع تجنب الفقاعات.
      ملاحظة: أضف 150 ميكرولتر مباشرة إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت وسيارات الدفع الرباعي الموجودة بالفعل ليصبح المجموع 200 ميكرولتر في بئر التفاعل.
   2. عندما تكون جاهزا لبدء الحضانة باستخدام الستينات أو بروتين مختلف من اختيارك ، اغسل الطبقة الثنائية 6x ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل (RXN: 33.3 ملي مولار KCl ، 50 ملي هيبس ، درجة الحموضة 7.4 ، 1.4 مجم / مل BSA ، 0.14٪ ميثيل السليلوز ، 1 ملي مولار BME).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، اجعل المخزن المؤقت للتفاعل جديدا وكن حذرا جدا أثناء خلط التفاعل جيدا لتجنب الفقاعات.
   3. في خطوة الغسيل الأخيرة ، قم بإزالة 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل ، مع ترك 75 ميكرولتر في البئر. أضف 25 ميكرولتر من السفنين المخفف في مخزن تخزين الحاجز (SSB: 300 ملي مولار KCl ، 50 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4 ، 1 ملي مولار BME) بالتركيز المطلوب والصورة بواسطة الفحص المجهري TIRF.
      ملاحظه: عند إعداد هذا الاختبار لأول مرة أو دمج تركيبة دهنية جديدة ، من الممارسات الجيدة التأكد من انتشار الدهون بحرية على السطح باستخدام استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP). في حين أن معدل الشفاء سيكون مختلفا باختلاف تركيبات الدهون وأقل بطبيعته من الأنظمة القائمة بذاتها ، يجب ألا تكون الدهون غير متحركة.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: مكونات المخزن المؤقت لإعداد طبقة الدهون الثنائية المدعومة والتفاعلات. يتم عرض أحجام محاليل المخزون المدمجة في المخازن المؤقتة والتركيزات النهائية لكل مكون. يمكن تخزين SLB و PRB في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامهما بين التجارب. يتم جعل المخزن المؤقت للتفاعل و SSB طازجا لكل تجربة.

المخزن المؤقت ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم (SLBB) رصيد حجم التركيز النهائي 2 م KCl 1.5 مل 300 ملم 1 م هيبس 200 ميكرولتر 20 ملم 500 ملي مللي كلوريد₂ 20 ميكرولتر 1 ملي متر الماء 8 مل ما قبل التفاعل (PRB) رصيد حجم التركيز النهائي 2 م KCl 166 ميكرولتر 33.3 ملي 1 م هيبس 500 ميكرولتر 50 ملم الماء 9.33 مل Reaction Buffer رصيد حجم التركيز النهائي 2 م KCl 166 ميكرولتر 33.3 ملي 1 م هيبس 300 ميكرولتر 50 ملم 10 مجم / مل BSA 1.39 مل 1.39 ملغم/مل 1٪ ميثيل سلولوز 1.39 مل 0.0014 الماء حتى 10 مل BME 0.7 ميكرولتر 1 ملي متر Septin Storage Buffer (SSB) رصيد حجم التركيز النهائي 2 م KCl 1.5 مل 300 ملم 1 م هيبس 500 ميكرولتر 50 ملم الماء حتى 10 مل BME 0.7 ميكرولتر 1 ملي متر

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي لغرفة التفاعل التي تم إعدادها. لتحضير غرف مخصصة ، يتم قطع أنبوب PCR سعة 0.2 مل حيث يبدأ الأنبوب في الاستدقاق وعند الغطاء (خطوط متقطعة حمراء). ثم يتم طلاء الحافة غير المقطوعة للأنبوب المقطوع بطبقة رقيقة من الغراء المنشط بالأشعة فوق البنفسجية (الأزرق) وتوضع على غطاء غطاء.

المواد