فحص ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم كرويا: تقنية لمراقبة تجميع septin على الكريات المجهرية

الملخص

المصدر: Curtis ، B. N. et al. ، إعادة تشكيل تجميع septin في الأغشية لدراسة الخصائص والوظائف الفيزيائية الحيوية. J. Vis. Exp. (2022).

يصف هذا الفيديو تقنية دراسة تجميع بروتين septin على الكريات المجهرية المغلفة بطبقات ثنائية الدهون. تساعد هذه التقنية في فهم تجميعات البروتين المعتمدة على الانحناء على الأسطح المنحنية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. طبقات ثنائية الدهون المدعومة كروية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول كريات السيليكا المجهرية المعلقة في ماء فائق النقاء بكثافة 10٪. بالنسبة لأي عمل على المعلمات الحركية لتجميع البروتين ، من المهم التحكم الصارم في إجمالي مساحة سطح الغشاء بين التجارب والانحناءات. يوضح الجدول 1 الأحجام المصححة للخرز والمخزن المؤقت للحفاظ على 5 مم² من إجمالي مساحة سطح الغشاء.

1. تشكيل ثنائي الطبقة
   ملاحظه: أما بالنسبة للطبقات الثنائية المستوية ، فمن المهم أن يكون لديك سيارات دفع رباعي عالية الجودة لتشكيل طبقة ثنائية القوة. يسرد الجدول 1 حجم الخرز من محلول كثافة 10٪ وأحجام SLBB الخاصة بها والتي تستخدم للحصول على مساحة سطح نهائية تبلغ 5 مم² لمجموعة من أقطار الخرز.
   1. تميل كريات السيليكا المجهرية (يشار إليها أيضا باسم الخرز) إلى الاستقرار والتكتل معا ؛ لخلط الخرزات وتفكيك أي مجموعات ، قم بدوامة الزجاجة لمدة 15 ثانية ، ثم سونيكات الحمام لمدة دقيقة واحدة ، والدوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية.
   2. امزج الحجم المناسب من الخرز (الجدول 1) مع الحجم المقابل ل SLBB و 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي 5 ملي في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق 0.5 مل.
   3. هز خليط الخرز والدهون من طرف إلى طرف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن هذه الحضانة تتم على دوار لمنع الترسيب.
2. تحضير الغرف على أغطية PEGylated
   ملاحظه: أما بالنسبة للطبقات الثنائية المستوية ، فيتم استخدام الغرف محلية الصنع من أنابيب PCR البلاستيكية لدعم أحجام التفاعل ، ولكن المواد الأخرى منخفضة الالتصاق ، مثل آبار السيليكون ، قد تعمل أيضا.
   1. أثناء تأرجح الخرزات ، قم بإذابة غطاء PEGylated في درجة حرارة الغرفة. قم بقص أنبوب PCR سعة 0.2 مل وألصقه على الغطاء كما هو موضح. بالنسبة للشرائح مقاس 24 مم × 50 مم ، يمكن أن تتناسب مع ما يصل إلى 10 غرف بشكل عملي على شريحة واحدة><. ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول أغطية زجاجية مقاس 24 مم × 50 مم يتم تحضيرها مسبقا. باختصار ، يتم تنظيف الأغطية الزجاجية تماما من خلال صوتنة في الأسيتون والميثانول و 3 M KOH. ثم يتم تشغيل الغطاءات باستخدام n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane وربطها تساهميا ب mPEG succinimidyl valerate. يتم تخزين أغطية PEGylated النهائية محكمة الغلق عند -80 درجة مئوية. بينما يتم اقتراح أغطية زجاجية PEGylated هنا ، قد تكون وسائل أخرى للتخميل ، مثل طرق BSA أو poly-L-lysine ، فعالة.
3. غسل الدهون الزائدة
   ملاحظه: تعمل هذه الخطوة على إزالة سيارات الدفع الرباعي الزائدة وإجراء تبادل عازل. يتم غسل الخرزات 4x في المجموع باستخدام المخزن المؤقت للتفاعل المسبق (PRB: 33.3 ملي مولار KCl ، 50 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4). يسرد الجدول 2 سرعات الدوران في RCF لمجموعة من أقطار الخرزة.
   1. تدور الخرز في RCF المعين لمدة 30 ثانية (الجدول 2). إذا كنت تستخدم أحجام حبة متعددة ، فاستمر في تأرجح الخرزات حتى يحين وقت غسلها.
      ملاحظه: لا يستحق ترسيب الخرز الأكبر حجما في نفس الدوران مثل الخرزات الأصغر مع سرعة ترسيب الخرزة الأصغر لتوفير الوقت. يمكن أن يتسبب ذلك في التصاق الخرزات ببعضها البعض وتعريض سلامة الطبقة الثنائية للخطر.
   2. بعد الدوران الأول ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدورات الثانية والثالثة ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وأضف 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدوران الرابع ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وأضف 220 ميكرولتر من PRB. ماصة بقوة لكل غسلة.
      ملاحظه: يختلف حجم إعادة التعليق النهائي عن الغسيل. لا تقم بتدوير الخرزات بعد الحضانة بالدهون لأن ذلك قد يترك فجوات في الطبقات الثنائية. لتجنب الترسيب أثناء العمل مع أحجام الخرز الأخرى أو إعداد أجزاء أخرى من الفحص ، ضع مخاليط الخرز مرة أخرى على الدوار النهائي.
4. تحضير رد الفعل
   1. إذا كنت تقوم بإجراء اختبار منافسة بأحجام حبة متعددة ، فقم بعمل خليط 1: 1 عن طريق خلط كميات متساوية من كل حجم حبة معا. بعد ذلك ، امزج 29 ميكرولتر من خليط الخرزة المطلوب (أو حبة واحدة) مع 721 ميكرولتر من مخزن RXN العازلة.
      ملاحظه: من المهم خلط الخرزات جيدا في كل خطوة باستخدام ماصة لتجنب مجموعات كثيفة من الخرز. سيؤدي ذلك إلى توزيع حبة أكثر توازنا ومساحة سطح إجمالية دقيقة.
   2. امزج 75 ميكرولتر من الخرز المخفف و 25 ميكرولتر من البروتين المخفف في SSB إلى الآبار.
      ملاحظه: عادة ما يصور المؤلفون مجمعات septin الخميرة عند 1-50 نانومتر.
   3. في حالة قياس الستين في حالة مستقرة ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ثم قم بالتصوير إما عن طريق الفحص المجهري القريب من TIRF أو الفحص المجهري متحد البؤر.
      ملاحظه: تم تصميم هذا التفاعل للحفاظ على مساحة سطح الغشاء الإجمالية للتفاعل عند 5 مم² وإنتاج حالة تفاعل نهائية تبلغ 100 ملي مولار KCl ، و 50 ملي مولار HEPES ، و 1 مجم / مل BSA ، و 0.1٪ ميثيل سليلوز ، و 1 ملي مولار BME.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: أحجام طبيعية من الكريات المجهرية. من أجل الحفاظ على مساحة سطح متساوية لكل حجم حبة والحفاظ على إجمالي مساحة سطح الغشاء متسقة بين التجارب ، تم حساب أحجام لكل حجم حبة ومخزن مؤقت تطبيع مساحة السطح الإجمالية.

قطر الخرزة (ميكرومتر) حجم الخرزات المختلطة جيدا (ميكرولتر) حجم المخزن المؤقت SLB (ميكرولتر) حجم سيارات الدفع الرباعي (ميكرولتر) 6.46 دولار 8.94 دولار 61.1 دولار 10 5.06 7 63 10 3.17 [إك] 4.39 65.6 10 0.96 1.33 دولار أمريكي 68.7 [إ] 10 0.54 0.75 دولار 69.3 [إ] 10 0.31 0.43 69.6 10

الجدول 2: سرعات الترسيب للكريات المجهرية بأقطار متفاوتة. لكل قطر حبة ، تم استخدام الحد الأدنى من سرعات الترسيب الموضحة لحبيبات الخرز لغسل الجسيمات الشحمية غير المرتبطة

قطر حبة (ميكرومتر) سرعة الترسيب (RCF) 0.31 4.5 0.54 4.5 0.96 2.3 3.17 [إك] 0.8 5.06 0.3

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.2 مل أنابيب PCR مع غطاء مسطح ، طبيعي واتسون 137-211 ج (EX) 0.5 مل أنابيب التصاق منخفضة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1405-2600 بيتا ميركابتو إيثانول (BME) سيجما ألدريتش M6250-100 مل ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 4612-25 جي غطاء زجاجي لصنع أغطية PEGylated الترمو: العلمية هاتف: 152450 ريتشارد آلان غطاء زجاجي 24x50 #1.5 دوبكسل أفانتي بولر ليبيدس 850375 بيض ليس رودامين PE أفانتي بولر ليبيدس 810146 هيبس سيجما ألدريتش H3375-1 كجم ميثيل السليلوز 4000cp سيجما ألدريتش M052-100G جهاز طرد مركزي صغير مجهرية السيليكا غير الوظيفية مختبرات بانغز ، وشركة يعتمد على الحجم: SS0200 * -SS0500 * السيليكا في معلق مائي لاصق بصري نورلاند ثورلاب نوا 68 لاصق مرن للزجاج أو البلاستيك كلوريد البوتاسيوم VWR 0395-1 كجم حمام سونيكاتور برانسون 1510R-MT منظف برانسونيك بالموجات فوق الصوتية. 50-60 هرتز الإخراج: 70 واط فول الصويا PI أفانتي بولر ليبيدس 840044 جهاز طرد مركزي منضدية إيبندورف هاتف: 22331 مصباح الأشعة فوق البنفسجية الطيف الطيفي ENF-260C 115 فولت ، 60 هرتز ، 0.20 أمبير