alamarBlue Assay: طريقة فلورومترية حساسة لفحص التأثيرات السامة للخلايا لتركيبات الدموع الاصطناعية على النشاط الأيضي للخلايا الظهارية للقرنية البشرية

الملخص

المصدر: Rangarajan ، R. et al. تأثير تركيبات الدموع الاصطناعية على النشاط الأيضي للخلايا الظهارية القرنية البشرية بعد التعرض للجفاف. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو مقايسة القياس الفلوري في المختبر لتقييم تأثيرات تركيبات الدموع الاصطناعية على النشاط الأيضي الخلوي للخلايا الظهارية للقرنية باستخدام محلول Alamar الأزرق القائم على الريزازورين. تحافظ التركيبة غير السامة على الخلايا في حالة صحية ونشطة من الناحية الأيضية ، مما يسهل اختزال الريزازورين إلى ريسوروفين عالي الفلورسنت.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ثقافة الخلايا الظهارية للقرنية البشرية

1. قم بزراعة HCEC الخالد في قوارير مغلفة بالكولاجين تبلغ مساحتها 75 سم مربع مع 20 مل من خليط النسر المتوسط / المغذيات المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظة: الاهتزاز غير مطلوب.
2. قم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا للاختبار

1. بعد أن تكاد تكون الخلايا ملتقية ، قم بإزالة وسائط الثقافة.
2. أضف 4-6 مل من محلول تفكك الخلايا إلى كل قارورة مساحتها 75 سم مربع. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (حوالي 20-30 دقيقة) ، وتحقق من المجهر بشكل دوري.
3. أضف 2-6 مل من DMEM/F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى كل قارورة مساحتها 75 سم مربع.
4. انقل محتويات القارورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
5. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450-500 × جم لمدة 5 دقائق.
6. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. احسب حجم الوسائط التي تحتوي على إجمالي 1 × 10⁵ خلايا.
7. أضف 1 × 10⁵ خلايا إلى كل بئر من صفيحة الثقافة المطلية بالكولاجين -1 المكونة من 48 بئرا. أضف كمية كافية من الوسائط إلى البئر بحيث يكون الحجم النهائي للوسائط في البئر 0.5 مل من الثقافة DMEM / F12 مع 10٪ FBS.
   ملاحظة: قد تسبب تركيبة الدموع الاصطناعية السمية الخلوية التي يمكن قياسها عن طريق انخفاض النشاط الأيضي ل HCEC. يعتمد تناسق البيانات على إضافة نفس العدد من HCEC إلى كل بئر عند البذر. تركيز الثقافة الموصى به ل 48 لوحة بئر هو 1 × 10⁵. نظرا لأن خلايا الثدييات يمكن أن تستقر في أنبوب الطرد المركزي بعد إعادة التعليق ، فمن المستحسن إعادة تعليق الخلايا عن طريق التحريك بشكل متكرر أثناء زرع الصفائح بالخلايا بحيث يتم توزيع HCEC بالتساوي في تعليق الخلية.
8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >3. لا يوجد بروتوكول تجفيف

1. إجراءات الرقابة
   1. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة وسائط الثقافة من اللوحة.
   2. يعالج على الفور ب 150 ميكرولتر من تركيبة الاختبار ومحلول التحكم في الوسائط.
   3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة.
   4. قم بإزالة محاليل الاختبار من الخلايا.
   5. أضف 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ لاختبار نشاط التمثيل الغذائي. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   6. بعد فترة الحضانة التي استمرت 4 ساعات ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من محلول الصبغة الأيضية من كل بئر وضع كل 100 ميكرولتر في بئر من صفيحة 96 بئر.
   7. قم بقياس تألق كل بئر باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت (جدول المواد). اضبط الطول الموجي للإثارة على 540 نانومتر والطول الموجي للانبعاث عند 590 نانومتر.
2. لا يوجد بروتوكول تجفيف (إجراء الاسترداد)
   1. كرر الخطوات 3.1.1−3.1.4.
   2. أضف 0.5 مل من وسائط DMEM / F12 إلى كل بئر.
   3. احتضان مجموعة واحدة من المزارع لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   4. قم بإزالة الوسائط وأضف 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪. كرر الخطوتين 3.1.6 و 3.1.7.

المواد