< p class = "jove_title" >1. تفاعلات ddPCR وإعداد توليد القطرات
- تحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور.
ملاحظه: بالنسبة لمقايسة الإنزال ، يوصى باستخدام مجموعة من 3,000-30,000 نسخة جينوم أحادية الصيغة الصبغية لكل تفاعل ، والتي تم تصميمها للكشف عن أحداث NHEJ باستخدام مسبار وضع العلامات على HEX يرتبط بتسلسل WT لموقع القطع المستهدف ولن يلدن (يسقط) إذا كان هناك حذف أو إدخال في الموقع المستهدف ، مما يشير إلى وجود متغير NHEJ.
- احسب رقم النسخة باستخدام وزن الجينوم أحادي الصيغة الصبغية وتركيز الحمض النووي في المستخلص. يتم ذلك عن طريق ضرب تركيز الحمض النووي المستخرج في الحجم المستخدم للحصول على كتلة الحمض النووي الكلية ، ثم قسمتها على وزن الجينوم أحادي الصيغة الصبغية. تأكد من أن الحجم المضاف يتراوح بين 1-10 ميكرولتر. خفف حسب الضرورة ليكون في نطاق نسخ الجينوم أحادي الصيغة الصبغية الموصى به.
ملاحظه: يقدر جينوم Anopheles gambiae أحادي الصيغة الصبغية ب 0.27 بيكوغرام لكل بعوضة بالغة.
- تصميم الاشعال والمجسات. صمم بادئات قليلة النوكليوتيدات الأمامية والعكسية بدرجة حرارة انصهار أولية (Tm) في حدود 55-60 درجة مئوية تحيط بالأطراف 5 و 3 من موقع gRNA المستهدف مما ينتج عنه أمبليكون من 150-400 نقطة أساس.
- مسبار سداسي (سداسي كلورو فلورسين) للكشف عن NHEJ: صمم مسبارا قليل النوكليوتيد بطول ~ 15-20 نقطة أساس مكملا للموقع المستهدف وأضف مسبار HEX إلى الطرف 5 'و BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) إلى النهاية 3'. يجب أن يكون Tm لمسبار التحلل المائي أعلى بمقدار 3-10 درجات مئوية من Tm للبادئات.
- مسبار FAM (6-carboxyfluorescein) المسمى للإشارة WT: صمم قليل النوكليوتيد ~ 15-20 نقطة أساس في الطول مكملا لموقع الجينوم المحفوظ البعيد (حوالي 25 نقطة أساس) عن الموقع المستهدف وأضف مسبار FAM إلى الطرف 5 'و BHQ1 إلى النهاية 3'. يجب أن يكون Tm لمسبار التحلل المائي أعلى بمقدار 3-10 درجات مئوية من Tm للبادئات.
فئة
2. تحضير تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
- قم بإعداد 25 ميكرولتر من مزيج عينات ddPCR بالمكونات التالية: ddPCR supermix للمجسات (بدون UTP): 12.5 ميكرولتر ، بادئات أمامية وعكسية (10 ميكرومتر): 1 ميكرولتر لكل منهما ، مجسات HEX / FAM (10 ميكرومتر): 0.625 ميكرولتر لكل منهما ، الحمض النووي: 1-5 ميكرولتر (3،750-37،500 نسخة جينوم أحادي الصيغة الصبغية) والماء: حتى 25 ميكرولتر.
- امزج التفاعلات جيدا عن طريق الدوامة أو سحب التدفق (لأعلى ولأسفل) (20x).
ملاحظه: إذا كانت التفاعلات في صفيحة سعة 96 بئرا، فقم بتحريك الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل 20 مرة بدلا من الدوامة لتجنب تكوين الفقاعات.
- باختصار ، قم بالطرد المركزي للعينات لتسوية الخليط في قاع الأنبوب أو البئر.
ملاحظه: تأكد من أن التفاعلات في درجة حرارة الغرفة لتوليد القطرات. قم بإعداد 1x من مزيج ddPCR للآبار الإضافية / غير المستخدمة في كل خرطوشة (تحتوي كل خرطوشة على 8 آبار).
< p class = "jove_title" >3. توليد القطرات
- باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 50 ميكرولتر، قم بتحميل 20 ميكرولتر من مزيج عينة ddPCR في الصف الأوسط من الخرطوشة (الشكل 1A، أعلى).
- قم بتحميل 70 ميكرولتر من الزيت في الصف السفلي. قم بتحميل 20 ميكرولتر من 1x ddPCR supermix في الآبار غير المستخدمة.
ملاحظه: لا تدخل الفقاعات.
- ضع الحشية التي تلامس الحواف فقط ، وتجنب المنطقة المقعرة المركزية (الشكل 1 ب).
- ضع اللوحة بإحكام في مولد القطرات وأغلق الغطاء لبدء التشغيل.
- باستخدام الماصة متعددة القنوات، انقل 40 ميكرولتر من مزيج الخرطوشة من الصف العلوي من الخرطوشة (الشكل 1A، أسفل) إلى اللوحة التي تحتوي على 96 بئرا.
- ارسم العينة السائلة لمدة 3-5 ثوان بزاوية 45-30 درجة. طرد الخليط ببطء لأكثر من 3 ثوان بزاوية 45 درجة في جانب البئر ، مما يسمح له بالتنقيط على الجانب. لا بأس في الذهاب إلى المحطة الثانية (الطرد الكامل) للماصة لطرد كل السائل.
- باستخدام أختام حرارية من رقائق الألومنيوم ، أغلق الألواح لمدة 5 ثوان عند 180 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >4. PCR
- ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري (الشكل 1 ج) واضبط شروط PCR الموصى بها إذا اتبعت إرشادات NHEJ Drop-Off على النحو التالي:
- التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- اضبط 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لتغيير طبيعتها ، و 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة للتلدين ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين للتمديد.
- امسك في 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- امسك عند 4 درجات مئوية
ملاحظه: يمكن تحسين درجة حرارة التلدين لبادئات ومجموعات مسبار محددة باستخدام تدرج حراري. استخدم معدل منحدر يبلغ 2 درجة مئوية / ثانية لجميع الخطوات. يجب تعديل شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل اعتمادا على كل تصميم وإعداد تجريبي.
5. قراءة القطرات
- ضع اللوحة بإحكام في قارئ القطرات مع البئر A-1 في الجزء العلوي الأيسر (الزاوية الملساء ، الثلاثة الأخرى ذات حواف) (الشكل 1 د).
- قم بإعداد اللوحة في البرنامج: تعيين FAM كقناة مرجعية معروفة و HEX كقناة غير معروفة (الشكل 2 أ).
- قم بتشغيل تجربة قراءة Droplet كقياس كمي مباشر. بعد انتهاء التشغيل، قم بتغيير نوع التجربة إلى Drop-Off (DOF) للتحليل (الشكل 2 أ).
