تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج لتحديد درجة حرارة التلدين المثلى

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tsujimoto، H. et al.، Indel Detection بعد CRISPR / Cas9 لطفرات باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة في Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج لتحسين درجة حرارة التلدين للبادئات ، والتي تحدد درجة حرارة التلدين المتدرج على طول الآبار. يتم تحديد تأثير درجات حرارة التلدين المختلفة من خلال إنتاجية المنتجات المضخمة التي تساعد على تحسين حالة التفاعل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. المسح بحثا عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، وتصميم HRMA التمهيدي ، والتحقق من صحة التمهيدي

1. تحديد SNP في البعوض المختبري البري
   1. حدد exon الهدف لتعطيل الترجمة الصحيحة لعديد الببتيد.
      ملاحظه: يجب أن يكون الهدف قريبا من كودون البداية أو بين المخلفات الرئيسية المطلوبة لوظيفة البروتين. كلما كان الإكسون أقصر (على سبيل المثال ، ≤200 قاعدة) ، زادت صعوبة استهدافه وتحليله. تجنب التحرير بالقرب من حدود exon ، لأن هذا يجبر أحد بادئات HRMA إما على عبور إنترون أو أن يكون في إنترون. هذا غير مرغوب فيه لأن معدلات SNP تميل إلى أن تكون أعلى بكثير في تلك المناطق.
   2. تصميم التمهيدي
      1. انتقل إلى موقع NCBI Blast - Primer Blast ، وانسخ والصق exon المختار في المربع الموجود أعلى الصفحة | اختر حجم منتج PCR (تأكد من أنه يشمل معظم exon) | اختر الكائن الحي.
      2. انقر فوق المعلمات المتقدمة | اختر (لمنتج PCR Tm) وأضف 60 (للحصول على درجة حرارة مثالية تبلغ 60 درجة مئوية) | احصل على الاشعال. احتفظ بالمعلمات الأخرى كإعداد افتراضي.
   3. الحصول على الحمض النووي الجيني (gDNA) من مستعمرة المختبر من النوع البري. ضع جانبا 10 بعوض ، وقم بتخديرها بثاني أكسيد الكربون₂ ، وضعها في طبق بتري على الثلج لإبقائها غير نشطة. قم بإعداد 10 أنابيب تحتوي على 0.5 ميكرولتر من الكاشف لإطلاق الحمض النووي من الأنسجة و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف ، وكلاهما متوفر في مجموعة إطلاق الحمض النووي المقترحة في جدول المواد.
   4. قم بإزالة ساق واحدة من بعوضة واحدة باستخدام ملقط وضعها في أنبوب مقابل لمحلول مخفف من كاشف إطلاق الحمض النووي (من الخطوة 1.1.3) ، مع غمر الساق تماما في المحلول. كرر هذه الخطوة مع البعوض المتبقي ، وامسح الملقط بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
   5. احتضان المحلول المحتوي على الساق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق ، ثم عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، واتركه يبرد أثناء إعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
      ملاحظه: يمكن تخزين اللوحات التي تحتوي على gDNA الذي تم إصداره عند -20 درجة مئوية ، ويمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة.
   6. قم بإعداد 10 أنابيب تحتوي على 10 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، والبادئات بتركيز نهائي 0.5 ميكرومتر ، وماء من الدرجة الجزيئية إلى حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر ، ونقل 1 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل أنبوب. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع معلمات ركوب الدراجات هذه: 98 درجة مئوية 5 دقائق ، 40 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 60 درجة مئوية 30 ثانية ، 72 درجة مئوية 20 ثانية لكل كيلو بايت ؛ التمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   7. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بإنزيم لتحلل بادئات PCR المتبقية وإزالة الفوسفور من dNTPs الزائدة أو أي مجموعة تنظيف للعمود. تابع تسلسل العينات.
   8. قم بتحليل كل مخطط كهربية لوجود قمم مزدوجة / قواعد غامضة ، واضبط المكالمات الأساسية يدويا في كل تسلسل باستخدام الكود الأساسي المتدهور المناسب.
      ملاحظه: يجب تنفيذ هذه الخطوة قبل محاذاة التسلسل المتعدد حيث أنه من الشائع أن يقوم برنامج استدعاء القاعدة بتحديد الذروة الأكثر بروزا باعتبارها المكالمة الأساسية "الحقيقية" ، مما يعطي انطباعا خاطئا بعدم وجود تعدد الأشكال
   9. قم بإجراء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام برنامج المحاذاة ، SeqMan Pro ، المدرج في جدول المواد أو برامج المحاذاة الأخرى مفتوحة المصدر ، مثل ClustalW أو T-Coffe.
      1. افتح برنامج المحاذاة | انقر فوق إضافة تسلسلات | حدد التسلسلات المطلوبة وانقر فوق إضافة | بمجرد اختيار جميع التسلسلات ، انقر فوق تم.
      2. انقر فوق تجميع لإجراء المحاذاة. لفتح المحاذاة ، انقر فوق Contig 1 وقم بتحليل المحاذاة وتحديد SNPs (الشكل 1).
         ملاحظه: كبديل للخطوات 1.1.3-1.1.6 ، يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من الحمض النووي الجيني المعزول الذي تم الحصول عليه من عينات سائبة (مشتقة من >10 أفراد). يمكن تحليل الأمبليكونات المتسلسلة مباشرة لوجود تعدد الأشكال التي تظهر كقمم مزدوجة في مخطط الكهربية ، على الرغم من صعوبة اكتشاف تعدد الأشكال النادرة.
   10. صمم 3-5 RNAs أحادية التوجيه (sgRNAs) ، وتجنب المناطق التي تحتوي على أي SNP المحددة أعلاه ، باتباع البروتوكول الموضح في.

فئة

2. تصميم HRMA التمهيدي

1. اختبر تسلسل exon للتكوين المحتمل للهياكل الثانوية أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام mFold.
   1. انتقل إلى خادم الويب UNAFold | انقر فوق mFold | في القائمة المنسدلة ، انقر فوق التطبيقات | شكل طي الحمض النووي.
   2. أدخل اسم التسلسل في المربع والصق exon.
   3. قم بتغيير درجة حرارة الطي إلى 60 درجة مئوية ؛ في الظروف الأيونية ، قم بتغيير [Mg ⁺⁺] إلى 1.5 ، وعلى الوحدات قم بالتبديل إلى mM ؛ انقر فوق Fold DNA.
   4. في الإخراج ، أسفل الهيكل 1 ، انقر فوق pdf لفتح مخططات الهيكل الدائري.
2. انتقل إلى NCBI Blast - Primer Blast لتصميم التمهيدي.
3. انسخ والصق تسلسل exon المحدد بواسطة التسلسل في الخطوة 1.1 (التسلسل الذي يحتوي على أقل عدد من تعدد الأشكال أو لا يحتوي على تعدد الأشكال أو لا توجد تعدد بسيط) في المربع الموجود أعلى الصفحة.
4. استخدم الرمز < > لتمييز واستبعاد التسلسلات التي تحتوي على تعدد الأشكال والموقع المستهدف والمناطق ذات التكوين المحتمل للبنية الثانوية.
5. حدد حجم منتج PCR ليكون بين 80 و 150 نقطة أساس واختر الكائن الحي.
   ملاحظه: يمكن استخدام أحجام الأجزاء الأكبر بنجاح (~ 300 نقطة أساس). ومع ذلك ، قد تقلل الأمبليكونات الأطول من الحساسية بين التسلسلات التي تختلف في أزواج أساسية واحدة أو بضعة أزواج فقط.
6. انقر فوق Get Primers. حدد 2-3 أزواج من البادئات ليتم اختبارها (من الناحية المثالية ، تكون مواقع التمهيدي على بعد ≥20-50 نقطة أساس من أي مواقع مستهدفة ل CRISPR).

3. التحقق من صحة التمهيدي

1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج باستخدام gDNA من فرد واحد.
   1. قم بإعداد مزيج رئيسي وإزالة عينة واحدة للتحكم غير القالب (NTC) في أنبوب منفصل. أضف القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقي وقم بتقطيعه إلى طبق 96 بئرا.
   2. اتبع معايير ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية 30 ثانية ، 34 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 55-65 درجة مئوية 30 ثانية ، 72 درجة مئوية 15 ثانية ؛ تمديد نهائي 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. قم بإنشاء ملفات تعريف الذوبان الحراري باتباع المعلمات: خطوة التمسخ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، والتلدين 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وكشف منحنى الذوبان بين 75 درجة مئوية و 95 درجة مئوية بزيادات قدرها 0.2 درجة مئوية ، مع وقت انتظار يبلغ 10 ثوان عند كل درجة حرارة.
      ملاحظه: يجب استخدام درجات حرارة التلدين فقط مع ملف تعريف ذوبان حراري واحد.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحديد SNP. تمثيل تخطيطي لمحاذاة التسلسل المتعدد لجزء AaeZIP11 من النوع البري. باللون الأحمر توجد SNPs ، وباللون الأخضر توجد شظايا خالية من SNPs. تقترح هذه المنطقة الخالية من SNP لتصميم sgRNA والبرايمر. الاختصارات: SNP = تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة. sgRNA = دليل واحد RNA ؛ LVP = سلالة ليفربول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 70٪ إيثانول 70٪ محلول إيثانول في الماء 96 جيدا PCR ولوحات PCR في الوقت الحقيقي VWR 82006-636 للحصول على الحمض النووي الجيني (من ساق البعوض) قوالب لوحة 96 بئر مطبوعة منزلية الصنع ، لتسجيل النمط الجيني بيو راد CFX96 بيو راد جهاز PCR مع إمكانات التدرج و HRMA خزانات كاشف التكنولوجيا الحيوية المتنوعة VWR 490006-896 مجموعة أدوات التنظيف السريع ل Exo-CIP نيو إنجلاند بيولابيس E1050S طبق بتري زجاجي VWR 89001-246 150 مم × 20 مم Nunc البولي أوليفين أكريليت الشريط الختم ، Thermo Scientific VWR 37000-548 للاستخدام مع ألواح PCR المكونة من 96 بئرا للحصول على الحمض النووي الجيني مجموعة PCR مباشرة للأنسجة الحيوانية من فير (بدون أدوات أخذ العينات) ثيرمو فيشر F140WH للحصول على الحمض النووي الجيني وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل برنامج تحليل الذوبان الدقيق بيو راد 1845025 تستخدم للتنميط الجيني لعينات الحمض النووي للبعوض وتحليل خصائص التمسخ الحراري للحمض النووي مزدوج الشريطة (انظر خطوة البروتوكول 3.3) ماصة أحادية القناة جيلسون مجموعة PCR مباشرة للأنسجة الحيوانية من فير (بدون أدوات أخذ العينات) ثيرمو فيشر F140WH للحصول على الحمض النووي الجيني وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل سيكمان برو برنامج DNAstar Lasergene لمحاذاة التسلسل المتعدد ماصة أحادية القناة جيلسون