$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير خليط الفحص
- قم بعمل تركيزات مخزون 100 ميكرولتر / لتر لجميع البادئات في الماء من الدرجة الجزيئية والمجسات في المخزن المؤقت TE pH 8 [Entero F1A ، Entero R1 ، GPL813TQ ؛ HF183-1 ، BthetR1 ، BthetP] .
ملاحظة: يتم تمييز مجسات الهدفين بالفلورسنت بفلوروفورات مختلفة كما هو موضح في قائمة المواد / المعدات.
- قم بإعداد المزيج الرئيسي عن طريق الخلط ، لكل تفاعل مخطط له ، 12 ميكرولتر من مزيج PCR الرقمي (مخزون 2x ، انظر قائمة المواد / المعدات) ، 0.216 ميكرولتر لكل برايمر أمامي وعكسي ، 0.06 ميكرولتر لكل مسبار فلوري ، و 5.016 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز (التركيز النهائي: 900 نانومتر لكل برايمر ، 250 نانومتر لكل مسبار). الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل للخلط مع توخي الحذر من إدخال فقاعات الهواء في المحلول.
- ماصة 18 ميكرولتر مزيج رئيسي (من الخطوة 1.2) في أنبوب أو لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العادية، وخلطها في قالب 6 ميكرولتر من الحمض النووي (مستخرج كما هو موضح سابقا) لعمل خليط فحص لتوليد القطيرات. في حالة تشغيل العينات في نسختين، قم بإدخال 36 ميكرولتر من المزيج الرئيسي و12 ميكرولتر من قالب الحمض النووي في كل بئر. اترك الآبار المتكررة المقابلة فارغة على اللوحة. قم بتضمين عناصر التحكم الإيجابية (انظر قائمة المواد / المعدات) وعدم وجود عناصر تحكم في القالب (NTC) (أي مع استخدام الماء من الدرجة الجزيئية كقالب).
ملاحظه: يعد التحكم الإيجابي ضروريا لضمان تشغيل الفحص بشكل صحيح وأن NTC ضروري لضمان عدم وجود تلوث داخل اللوحة وتعيين خط الأساس الفلوري لاحقا في تحليل البيانات. ينصح المستخدمون لأول مرة باستخدام عينات الحمض النووي غير المخففة والمخففة.
< p class = "jove_title" >2. توليد القطرات وإعداد لوحة PCR
- امزج مخاليط الفحص عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تأكد من بقاء طرف الماصة داخل السائل لتجنب تكوين فقاعات زائدة داخل الخليط.
- أدخل الخرطوشة 1 (التي تحتوي على 8 آبار) في حامل خرطوشة أبيض وانقر فوق حامل الخرطوشة للإغلاق. الخرطوشة 1 الآن ثابتة في مكانها ولا يمكن إزاحتها من الحامل أثناء توليد القطرات. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 20 ميكرولتر من خليط الفحص برفق إلى الموضع الأوسط للخرطوشة التي تحمل علامة "عينة" دون إدخال فقاعات هواء.
- ماصة في 70 ميكرولتر من زيت توليد القطرات على الجانب الأيسر من الخرطوشة (يحمل علامة "زيت").
- قم بتغطية الخرطوشة بحشية مع التأكد من أن الحشية مسطحة ومثبتة بالتساوي بواسطة 4 علامات باتجاه حافة الخرطوشة. اضغط على الزر المضاء باللون الأخضر في مولد القطرات لفتح الخرطوشة ووضعها اضغط على الزر المضاء باللون الأخضر مرة أخرى لإغلاق المولد.
ملاحظه: بمجرد إغلاق الباب ، يتم تعتيم الزر ، ولا يمكن إعادة فتح الباب ويبدأ توليد القطرات على الفور لمدة 1 دقيقة تقريبا.
- إذا قمت بأكثر من 8 تفاعلات ، فضع الخرطوشة 2 في حامل خرطوشة بيضاء ثان وقم بإعدادها بنفس طريقة الخرطوشة 1 أثناء تقدم إنشاء القطرات لتوفير وقت الإعداد الإجمالي.
- افتح باب مولد القطرات عندما يتحول الزر ذي الإضاءة الخافتة إلى اللون الأخضر مما يشير إلى اكتمال توليد القطرات. قم بإزالة حامل الخرطوشة الأبيض الذي يحتوي على الخرطوشة 1 ، واتركه جانبا ، وضع الخرطوشة 2 على مولد القطرات.
- قم بإزالة الحشية من الخرطوشة 1 وتخلص منها. انقل الحجم الإجمالي برفق (حوالي 40 ميكرولتر) من القطرات المتولدة من العمود الثالث من الخرطوشة (المشار إليها ب "قطرات") إلى لوحة PCR نهائية (يتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة) للدورة الحرارية.
ملاحظه: لا تقم بإلغاء النقر فوق حامل الخرطوشة الأبيض لأن الإجراء قد يكسر القطرات التي تم إنشاؤها حديثا. افتح حامل الخرطوشة فقط بعد نقل القطرات إلى اللوحة النهائية.
- كرر الخطوات 2.1-2.7 للحصول على عينات إضافية.
- عندما تكون جميع القطرات في لوحة PCR النهائية ، ضع غطاء رقائق معدنية قابل للثقب أعلى اللوحة وضعه على جهاز مانعة للتسرب من اللوحة. اضبط المادة المانعة للتسرب على 180 درجة مئوية ، واضغط على "تشغيل" على مانع التسرب واتركه يغلق لمدة 10 ثوان.
< p class = "jove_title" >3. ركوب الدراجات الحرارية وقراءة القطرات
- ضع اللوحة محكمة الغلق على الدراجة الحرارية ، واحدة متوافقة مع لوحة PCR النهائية المستخدمة في الخطوة 2.7 ، وسرعة زيادة درجة الحرارة تبلغ 2.0 درجة مئوية / ثانية.
- قم بتشغيل البرنامج الحراري على النحو التالي: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية ، تليها 40 دورة مدة كل منها 30 ثانية عند 94 درجة مئوية و 60 ثانية عند 60 درجة مئوية ، متبوعة بتعليق لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية (اختياري: تعليق نهائي عند 4 أو 15 درجة مئوية).
- عند الانتهاء من ركوب الدراجات ، انقل اللوحة إلى قارئ القطرات للقياس التلقائي للتألق في كل قطرة في كل بئر. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل قراءة القطيرات. تأكد من أن القطرات في درجة حرارة الغرفة قبل متابعة القراءة.
- افتح البرنامج المصاحب لإعداد قراءة القطرات. في قائمة "الإعداد" الافتراضية التي تحتوي على مخطط للوحة 96 بئر فارغة ، انقر نقرا مزدوجا فوق البئر A1 لفتح القائمة التي تحتوي على ثلاثة أقسام: "عينة" و "فحص 1" و "مقايسة 2".
- في قسم "عينة"، اكتب معرف العينة في المربع المسمى "الاسم" واضغط على Enter أو حدد المربع الموجود على اليمين الذي يحمل علامة "تطبيق". بعد ذلك، انقر على القائمة المنسدلة المسماة "تجربة" واختر "RED" (اكتشاف الأحداث النادرة)، وانقر على إدخال.
- انتقل إلى القسم الذي يدل على "الفحص 1". في قسم "الاسم" ، املأ المقايسة (مثل المكورات المعوية) وانقر فوق إدخال. في المربع أدناه المسمى "النوع"، انقر على القائمة المنسدلة واختر "القناة 1 غير معروفة" وانقر على إدخال.
- انتقل إلى القسم الذي يدل على "الاختبار 2". في قسم "الاسم" ، املأ الفحص (على سبيل المثال HF183) وانقر فوق إدخال. في المربع أدناه المسمى "النوع" ، انقر فوق القائمة المنسدلة واختر "القناة 2 غير معروفة" وانقر فوق إدخال. جميع المعلومات من الخطوات 3.3.2 إلى 3.3.4 موجودة الآن في البئر A1.
- قم بتسمية جميع الآبار اللاحقة التي تحتوي على قطرات. لتوفير إجمالي وقت الإعداد ، انقر فوق "Shift" أو "Ctrl" لاختيار آبار متعددة في وقت واحد.
- عندما يعكس التصوير الرقمي للوحة اللوحة المادية ، اضغط على "موافق" في أسفل يمين القائمة. في القائمة الجديدة التي تظهر في الجزء العلوي من مخطط اللوحة ، ضمن قسم "القالب" ، اختر "حفظ باسم" وقم بتسمية اللوحة واحفظها.
- على يسار الشاشة ، انقر فوق "تشغيل" وحدد مجموعة الصبغات المناسبة في نافذة "خيارات التشغيل" المنبثقة. يبدأ جمع البيانات ويتم عرضه في الوقت الفعلي في البرنامج.