مقالة منهجية

تفاعل البوليميراز المتسلسل الحجب من النوع البري للكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Albitar ، A. Z. et al. ، Wild-type Blocking PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كطريقة شديدة الحساسية للكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل المانع من النوع البري ، أو WTB-PCR ، الذي يكتشف الطفرات الجسدية. تستخدم التقنية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل حمض نووي مغلق ، أو LNA ، وهو قليل النوكليوتيد يرتبط بأليل البري التكميلي ويمنع استطالةه. يسمح الحجب بشكل انتقائي بتضخيم الأليلات الطافرة منخفضة المستوى على متغيراتها البرية في العينة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. استخراج الحمض النووي من أنسجة FFPE والدم المحيطي وشفط نخاع العظام

  1. لأنسجة نخاع العظم FFPE مع مجموعة استخراج DNA FFPE
    1. ابدأ بأنسجة FFPE من الشرائح غير الملوثة (5-10 أقسام بسمك 5 - 10 ميكرومتر).
      ملاحظه: إذا بدأت بنشارة الأنسجة ، فاستخدم 3-6 أقسام بسمك 5-10 ميكرومتر وتخطي إلى الخطوة 1.1.6.
    2. ضع الشرائح في سلة منزلقة وقم بإعداد أربعة خزانات غسيل (اثنان للزيلين واثنان للكحول بنسبة 100٪). أضف حجما لا يقل عن 600 مل من المحلول لكل سلة.
    3. قم بإزالة الشرائح عن طريق غسل الزيلين لمدة 5 دقائق في الدرج الأول. انقل الشرائح إلى خزان غسيل الزيلين الثاني لمدة 5 دقائق إضافية.
    4. بعد إزالة البارافينات ، اغسل الشرائح بالكحول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. انقل الشرائح إلى خزان غسيل الكحول الثاني لمدة 5 دقائق إضافية.
    5. اترك الشرائح تجف تماما تحت غطاء المحرك قبل كشطها بشفرة حلاقة في أنبوب طرد مركزي دقيق.
      ملاحظه: إذا كانت شريحة H & E مع منطقة الورم المشار إليها متوفرة ، فقم بمحاذاة الشرائح وكشط منطقة الورم فقط.
    6. تابع التعليمات الواردة من نشرة الشركة المصنعة المضمنة في المجموعة.
  2. لشفط BM والدم المحيطي
    1. استخرج وفقا لنشرة تعليمات الشركة المصنعة بهذه المواصفات.
      ملاحظه: هناك العديد من المجموعات والطرق المتاحة تجاريا لاستخراج الحمض النووي من أنسجة وخلايا FFPE. عمليا ، يمكن استخدام كل شيء. استخدم طريقة تم إنشاؤها في المختبر.
      1. استخدم 200 ميكرولتر من الدم المحيطي (PB) أو 100 ميكرولتر BM + 100 ميكرولتر من PBS.
      2. استخدم محلول مخزون 4 ميكرولتر RNase A.
      3. Elute مع 100 ميكرولتر عازلة شطف.
  3. القياس الكمي للحمض النووي
    1. قم بقياس تركيزات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي لضمان نسبة 260 نانومتر / 280 نانومتر تبلغ حوالي 1.8 (للحمض النووي النقي). إذا كانت النسبة أقل بشكل ملحوظ ، فقد يشير ذلك إلى وجود بروتين أو فينول أو ملوثات أخرى قد تتداخل مع التطبيقات النهائية.
    2. اضبط تركيزات الحمض النووي إلى حوالي 50 - 100 نانوغرام / ميكرولتر مع مخزن مؤقت مناسب للشطف.

2. تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري

  1. تصميم التمهيدي
    1. تصميم والحصول على بادئات للجينات ذات الأهمية وفقا للإرشادات العامة الموضحة سابقا لتصميم برايمر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتضمين بادئات التسلسل العالمي M13 الأمامية والعكسية في بادئات PCR.
      ملاحظه: تم تطوير اختبار MYD88 لتضخيم exon 5 من MYD88 (G259 - N291) و 110 نيوكليوتيدات تقع في المنطقة 5 'intronic لتغطية موقع لصق وجزء من intron 4. تم تصميم البادئات الأمامية والخلفية بتسلسل 5'-M13 (M13- إلى الأمام: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-عكسي: cag gaa aca gct atg acc) للسماح بتلدين بادئات التسلسل التكميلية (انظر جدول المواد).
  2. تصميم قليل النوكليوتيد الحمض النووي المقفل
    1. صمم قليل النوكليوتيد المانع ليكون طوله حوالي 10-15 قاعدة ومكملا لقالب WT حيث يكون التخصيب الطافرة مطلوبا.
      ملاحظه: سيؤدي أوليغو الأقصر إلى تحسين التمييز في عدم التطابق. لتحقيق خصوصية عالية الهدف ، من المهم عدم استخدام الكثير من النيوكليوتيدات الحاجزة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى قليل النوكليوتيدات "اللزجة" للغاية. يجب تحسين المحتوى والطول والنيوكليوتيدات الحظرية وفقا للنيوكليوتيدات المحددة التي يجب حظرها. من المهم تحقيق خصوصية ربط عالية دون المساس بالهيكل الثانوي والمخاطرة بالتكامل الذاتي.
    2. صمم oligo المانع بحيث يكون Tm 10-15 °C أعلى من درجة حرارة التمدد أثناء التدوير الحراري. اضبط Tm عن طريق إضافة أو إزالة قواعد الحجب أو عن طريق استبدال قواعد الحجب بالحمض النووي مع تجنب الامتدادات الطويلة (3-4 قواعد) لحجب قواعد G أو C.
      1. انتقل إلى موقع أدوات Oligo (انظر جدول المواد) وحدد أداة "حظر Oligo Tm Prediction".
      2. الصق تسلسل قالب WT المطلوب حظره في مربع "Oligo Sequence". أضف "+" أمام القواعد للإشارة إلى قواعد الحاظر.
      3. حدد الزر "حساب" لتحديد Tm التقريبي لهجين حائل الحمض النووي.
    3. صمم oligo المانع لتجنب تكوين الهيكل الثانوي أو الثنائيات الذاتية.
      1. انتقل إلى موقع أدوات Oligo على الويب (انظر جدول المواد) وحدد أداة "حظر Oligo Optimizer".
      2. الصق تسلسل قالب WT المطلوب حظره في المربع. أضف "+" أمام القواعد للإشارة إلى قواعد الحظر.
      3. حدد المربعين ل "الهيكل الثانوي" و "الذات فقط". اضغط على الزر "تحليل" لمراجعة oligo بحثا عن الهياكل الثانوية التي يحتمل أن تكون مزعجة أو dimers الذاتية.
        ملاحظه: تمثل الدرجات تقديرات تقريبية جدا ل Tm للهياكل الثانوية والثنائيات الذاتية. وبالتالي فإن الدرجات المنخفضة هي الأمثل ويمكن تحقيقها عن طريق الحد من الاقتران بين مانع الحاجز. تم تصميم قليل النوكليوتيد المانع ل MYD88 [مانع MYD88 (TCAGA + AG + C + G + G + A + C + T + C / CC / invdT /)] لتغطية الأحماض الأمينية Q262-I266 ويتميز ب 3 'dT مقلوب لتثبيط كل من الامتدادات بواسطة بوليميراز الحمض النووي والتحلل بواسطة 3'-exonuclease. oligo الحظر المحدد هذا هو 17 mer مع 10 قواعد حظر يشار إليها باسم "+ N". القواعد السبعة المتبقية هي نيوكليوتيدات الحمض النووي العادية.
  3. إعداد WTB-PCR وركوب الدراجات الحرارية
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي WTB-PCR (MMX) باستخدام 2.5 ميكرولتر من محلول تفاعل PCR 10x مع 20 ملي مولار MgCl2 ، و 250 ميكرومتر dNTPs ، و 0.2 ميكرومتر برايمر للأمام والعكسي ، و 1.2 ميكرومتر مانع MYD88 ، و DNAse ، خال من RNAse ، وعالي النقاء H2O لإنشاء حجم محلول نهائي يبلغ 21.75 ميكرولتر لكل تفاعل.
      ملاحظه: تركيزات العمل هي لحجم التفاعل النهائي البالغ 25 ميكرولتر (بعد إضافة قالب الحمض النووي والبوليميراز). يتم تحضير PCR MMX التقليدي ببساطة عن طريق حذف إضافة مانع تظل جميع خطوات البروتوكول متطابقة لكل من WTB و PCR التقليدي. يمكن استخدام هذا في التحقق من صحة وتحديد التخصيب الذي يتم تحقيقه عن طريق إضافة مانع
      1. عند حساب كمية MMX المراد تحضيرها، تأكد من حساب 3 تفاعلات إضافية (عناصر تحكم إيجابية وسالبة وتحكم غير قالب للتحقق من التلوث) وتفاعل إضافي واحد على الأقل لخطأ سحب العينات.
    2. دوامة MMX تماما. يمكن تخزين MMX عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
    3. أضف 0.25 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي Taq لكل تفاعل إلى MMX واقلبها للخلط. بمجرد إضافة البوليميراز إلى MMX ، احتفظ به على الجليد.
    4. ضع لوحة PCR جديدة سعة 96 بئرا على صفيحة باردة وماصة 22 ميكرولتر من MMX مع البوليميراز لكل تفاعل جيد.
    5. أضف 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني (50 - 100 نانوغرام / ميكرولتر إلى كل بئر من الآبار التي تحتوي على MMX مع البوليميراز.
    6. أغلق اللوحة وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة للتأكد من وصول المحلول إلى قاع كل بئر.
    7. قم بتحميل لوحة PCR على جهاز التدوير الحراري.
      1. اضبط شروط التدوير الحراري لتفاعل WTB-PCR على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ؛ 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، التلدين التمهيدي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 ثانية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
        ملاحظه: تتضمن أفضل الممارسات إكمال ما تبقى من البروتوكول في منطقة منفصلة ماديا لتجنب تلوث الكتلة في الإعدادات المستقبلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 أو 2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن إيبندورف 05-402-25 100٪ كحول VWR 89370-084 درجة الأنسجة ؛ 91.5٪ إيثانول ، 5٪ كحول الأيزوبروبيل ، 4.5٪ كحول الميثيل رقائق مانعة للتسرب من الألومنيوم جيني ميت تي -2451-1 لتفاعل البوليميراز المتسلسل والتخزين البارد جهاز الطرد المركزي 5804 سلسلة إيبندورف A-2-DWP الدوار (للوحة PCR) صفيحة باردة لألواح 96 بئر إيبندورف Z606634 DNAse ، خال من RNAمياه فائقة النقاء dNTPs (100 مل) إنفيتروجين 10297-117 الإيثانول المطلق سيغما E7023 200 برهان ، للبيولوجيا الجزيئية موقع إكسيكون أوليجو تولز http://www.exiqon.com/oligo-tools بوليميراز الحمض النووي FastStart Taq (5 U / μL) روش 12032937001 مع 10x المخزن المؤقت لتفاعل البوليميراز المتسلسل المركز ، مع 20 ملي مللي كلوريد 2 جهاز الرحلان الكهربائي للهلام 2٪ جل الاغاروز قليل النوكليوتيد LNA إكسيكون 500100 5'-TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT / (+ N = قواعد LNA) Mastercycler برو S Thermocycler إيبندورف E950030020 جهاز طرد مركزي دقيق موديل 5430 إيبندورف الدوار FA-45-30-11 (لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 / 2 مل) مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 ثيرمو فيشر العلمي برايمر أمامي PCR آي دي تي 5'-tgt AAA ACG ACG GCC AGT TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG التمهيدي العكسي PCR آي دي تي 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA لوحات PCR جيني ميت تي -3107-1 الماصات 20 ، 200 ، 1،000 ميكرولتر QIAamp DNA Mini Kit كياجين 51304 لشفط BM والدم المحيطي دوامة الجني الصناعات العلمية SI-0236 سلة منزلقة

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LNA

مقالات ذات صلة