$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير تفاعلات qPCR
ملاحظة: تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعينة واحدة. يحتوي كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على 5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي (انظر المواد) ، و 1 ميكرولتر من مزيج زوج التمهيدي 5 ميكرومتر ، و 2 ميكرولتر من H2O ، و 2 ميكرولتر من عينة العاثيات T7 المعالجة حراريا. بالنسبة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعددة ، يتم خلط جميع الكواشف باستثناء عينة العاثية مسبقا في أنبوب واحد سعة 1.5 مل. يعتمد حجم كل كاشف في الخلطة المسبقة على عدد عينات العاثيات ل qPCR.
- قم بإعداد المزيج المسبق qPCR ل 10 عينات من العاثيات الحيوية ذات التركيز غير المعروف و 7 عينات من التركيزات القياسية في ثلاث نسخ. نتيجة لذلك ، هناك 51 عينة إجمالية وبالتالي ، 51 تفاعل qPCR (أي تفاعل واحد لكل عينة). بالنسبة ل 51 تفاعلا ، قم بإعداد خلط أولي من 255 ميكرولتر من المزيج الرئيسي qPCR (51 × 5 ميكرولتر) ، و 51 ميكرولتر من البادئات (51 × 1 ميكرولتر) ، و 102 ميكرولتر من H2O (51 × 2 ميكرولتر).
ملاحظه: يوصى بإعداد عدد قليل من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافية للتعويض عن فقدان الحجم أثناء نقل مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل بئر من لوحة qPCR المكونة من 96 بئرا.
- Aliquot 8 ميكرولتر من الخلطة المسبقة PCR في كل بئر من لوحة qPCR 96 جيدا ليصبح المجموع 51 بئرا (أي 51 تفاعل qPCR). ليست هناك حاجة لتغيير النصائح أثناء الاقتباس.
- أضف 2 ميكرولتر من عينات العاثيات T7 المعالجة حراريا أو الحمض النووي المرجعي للعاثية T7 لكل بئر (الشكل 1 ب) ؛ قم بتغيير النصائح عند إضافة عينات مختلفة من الحمض النووي إلى البئر لمنع التلوث المتبادل. أيضا ، قم بتوزيع عينات الحمض النووي سعة 2 ميكرولتر تحت سطح الخلطة الأولية qPCR (أي في خلطة PCR سعة 8 ميكرولتر).
- ختم لوحة qPCR بغشاء لاصق.
ملاحظه: هذه الخطوة مهمة ، بغض النظر عن نوع لوحة qPCR. استخدم المجموعة الموصى بها لإغلاق اللوحة تماما ؛ خلاف ذلك ، فإن أي منطقة غير محكمة الغلق في اللوحة ستسبب فقدان الحجم أثناء تدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- لف لوحة qPCR بورق الألمنيوم لتقليل التبييض الضوئي الفلوري والمضي قدما في تشغيله على معدات qPCR.
2. شروط ركوب الدراجات qPCR
ملاحظة: تم إعداد شروط ركوب الدراجات qPCR على معدات qPCR المحددة.
- قم بتشغيل لوحة qPCR ذات 96 بئرا على جهاز qPCR. على الجهاز ، حدد الإعدادات من القائمة لإعداد الشروط التجريبية التالية (الشكل 1C).
- قم بإعداد ظروف التدوير على النحو التالي لحجم عينة يبلغ 10 ميكرولتر: دورة واحدة عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ودورة واحدة عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 40 دورة (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة). بعد ذلك ، قم بتشغيل إعدادات منحنى الذوبان: دورة واحدة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
- تابع لتحليل البيانات.
