مقالة منهجية

تفاعل البوليميراز المجهري لتضخيم الحمض النووي أحادي الشريطة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lee، S. H. et al.، نهج ميكروفلويدي قائم على القطرات وتضخيم المجهري-PCR لمضخمات الحمض النووي أحادية الشريطة. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو تقنية تضخيم الحمض النووي أحادي الشريطة باستخدام كريات بوليمر مطلية بقليل النوكليوتيدات في تفاعل أحادي الأنبوب. تنتج هذه العملية حمض نووي نقي أحادي الشريطة ، والذي يمكن استخدامه بشكل أكبر لتسلسل الحمض النووي وتحليل المصفوفات الدقيقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل لتضخيم ssDNA

  1. قم بإعداد مزيج كاشف PCR غير متماثل لتضخيم ssDNA المراد تحليله. قم بإذابة الكواشف في الجدول 1 على الجليد. لا تحتفظ بإنزيم بوليميراز Taq (50 وحدة / ميكرولتر) على الثلج ، بل قم بتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية لحين الحاجة.
  2. قم بدوامة جميع الكواشف برفق ثم أنابيب الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 10,000 × جم لمدة 10 ثوان.
  3. اجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 1.
  4. ضع العينات في جهاز تدوير حراري وابدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل في ظل الظروف التالية: 25 دورة (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، احتفظ بها عند 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >2. Microsphere-PCR لتضخيم ssDNA

ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكول تضخيم ssDNA في أنبوب تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم إجراء تفاعلات Microsphere-PCR في 50 ميكرولتر من حجم التفاعل. التسلسلات التفصيلية المستخدمة لتضخيم ssDNA مذكورة في الجدول 2. في هذه الحالة ، يمكن أن يلدن Ap على سطح الكريات المجهرية إلى قوالب الحمض النووي العشوائية بطريقة تكميلية. هذه خطوة مهمة للغاية لإنتاج خيوط الحمض النووي التكميلية (خيط الحمض النووي المضاد للمعنى ، الشكل 1). يستخدم الحمض النووي الموسع كقالب لتضخيم PCR المجهري.

  1. تحضير مزيج كاشف microsphere-PCR. قم بإذابة الكواشف في الجدول 3 على الجليد ؛ ومع ذلك ، لا تحتفظ بإنزيم Taq polymerase على الجليد. قم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
  2. قم بدوامة جميع الكواشف برفق ثم أنابيب الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 10,000 × جم لمدة 10 ثوان.
  3. احصل على ما يقرب من ~ 25 كرة مجهرية من خلال العد المجهري.
    ملاحظه: يتم حساب عدد الكريات المجهرية في أنبوب تفاعل واحد باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 40X. يتم استخدام حوالي ~ 25 كرة مجهرية لتضخيم المجهري PCR. توجد معلومات أكثر تفصيلا في الخطوة 3.
  4. اجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 3.
  5. ضع العينات في جهاز تدوير حراري وابدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل في ظل الظروف التالية: 25 دورة (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، احتفظ بها عند 4 درجات مئوية.
  6. بعد التضخيم ، أضف 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 6x وقم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة في هلام الاغاروز بنسبة 2٪. بعد ذلك ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة في 1x TAE (Tris-acetate-EDTA ، 40 ملي مولار Tris-acetate ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8.2).
< p class = "jove_content" > الجدول 1. مكونات مزيج كاشف PCR غير المتماثل في تفاعل 20 ميكرولتر.

الكاشف حجم تفاعل 1x (ميكرولتر) التركيز النهائي قالب الحمض النووي العشوائي 1 1 نانوغرام / ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام 1 0.4 ميكرومتر التمهيدي العكسي 1 0.02 ميكرومتر 10X Taq عازلة 5 1 مرة 10 ملي مولار من dNTP 4 2.5 ملي السابقين (1000U) 0.2 1 وحدة الماء 37.8 دولار - مجموع 50 - < p class = "jove_content" > الجدول 2. معلومات التسلسل ل Microsphere-PCR.

قالب تسلسل الطول (nt) قالب الحمض النووي العشوائي 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (تسلسل عشوائي ، 40 مر) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3 ' 76 علامة التمهيدي إلى الأمام (Tag-F) 5 '- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3 ' 42 التمهيدي العكسي 5 '- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' 18

الجدول 3. مكونات مزيج كاشف Microsphere-PCR في تفاعل 50 ميكرولتر

الكاشف حجم تفاعل 1x (ميكرولتر) التركيز النهائي Ap-المجهرية ~ 25 كرة مجهرية - قالب الحمض النووي العشوائي 1 1 نانوغرام / ميكرولتر علامة إلى الأمام التمهيدي 1 0.4 ميكرومتر 10X Taq عازلة 5 1 مرة 10 ملي مولار dNTP 4 2.5 ملي السابقين (1000U) 0.2 1 وحدة الماء 37.8 دولار - مجموع 50 -

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: رسم توضيحي لبروتوكول microsphere-PCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 40٪ أكريلاميد: محلول مكرر (19: 1) بيو راد 1610140 مكونات الكرة المجهرية قليلة البلمرة المشتركة بيرسلفات الأمونيوم ، APS سيجما ألدريتش أ 3678 مقوي مادة الأكريلاميد: محلول مكرر N ، N ، N ′ ، N ′- رباعي ميثيل إيثيلين ديامين ، TEMED سيجما ألدريتش تي 9281 محفز بيرسلفات الأمونيوم الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش م 5904 الجدول 1. الحل الثالث. مكون من الكواشف المجهرية مسبار ssDNA المسمى أكريديت بيونير توليفها الجدول 1. الحل I. مكون الكواشف المجهرية تريس بيوسيسانغ تي 1016 مكونات المخزن المؤقت TE ، محلول عازلة الأس الهيدروجيني EDTA سيجما ألدريتش EDS مكونات المخزن المؤقت TE ، إزالة الأيون (Ca2+) اكس طاق تاكارا RR001 أ تضخيم ssDNA T100 التدوير الحراري بيو راد 1861096 تضخيم ssDNA

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة