Nested-PCR للكشف عن تسلسل جيني فيروسي معين

الملخص

المصدر: Feng, Y., et al. تقييم تفاعل بوليميراز متسلسل عالمي متداخل للنسخ العكسي للكشف عن فيروسات Lyssa. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، وهي تقنية تتكون من عمليتين متتابعتين لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعتين أوليتين. تهدف المجموعة الأولى من الاشعال إلى تلدين التسلسلات في المنبع من المجموعة الثانية ، مما يؤدي إلى تضخيم انتقائي لتسلسلات جينية معينة. يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل أكثر حساسية وتحديدا من تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي ويستخدم على نطاق واسع كتقنية للكشف عن الأمراض المختلفة.

البروتوكول

1. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي الفيروسي

1. قم بإزالة كواشف RT المدرجة في الجدول 1 من الفريزر ، واحتفظ بها على الجليد ، وقم بإذابة الثلج ودوامة قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد 12 ميكرولتر من مزيج تفاعل RT في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 0.2 مل مع الكواشف المدرجة في الجدول 1. اسمح باختلافات سحب العينات عن طريق تحضير حجم من المزيج الرئيسي بحجم تفاعل واحد على الأقل أكبر من المطلوب.
3. أضف عينة 8 ميكرولتر أو RNA للتحكم الإيجابي أو التحكم السلبي إلى مزيج تفاعل RT داخل محطة عمل PCR في غرفة القوالب. التحكم الإيجابي RT هو الحمض النووي الريبي المستخرج من مزرعة الخلية المصابة بسلالة RABV الثابتة CVS-11 (معيار ف....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ddH₂O مختلف مختلف dNTPs (10 ملليمتر) تاكارا 4019 dNTPs (2.5 ملم) تاكارا 4030 Ex-Taq (5 U / μL) تاكارا RR001 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مختلف مختلف النسخ العكسي M-MLV (200 وحدة دولية / ميكرولتر) تاكارا 2641 أ أوليغو (dT)15 تاكارا 3805 آلة PCR بيو راد تي 100 أنابيب PCR مختلف مختلف الماصات مختلف مختلف التمهيدي العشوائي تاكارا 3801 ريال مثبط RNase (40 وحدة دولية / ميكرولتر) تاكارا 2313 أ ddH₂O خال من RNase تاكارا 9102 طاق عازلة (10x) تاكارا 9152 أ النصائح مختلف مختلف خلاط دوامة مختلف مختلف