Nested-PCR للكشف عن تسلسل جيني فيروسي معين

الملخص

المصدر: Feng, Y., et al. تقييم تفاعل بوليميراز متسلسل عالمي متداخل للنسخ العكسي للكشف عن فيروسات Lyssa. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، وهي تقنية تتكون من عمليتين متتابعتين لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعتين أوليتين. تهدف المجموعة الأولى من الاشعال إلى تلدين التسلسلات في المنبع من المجموعة الثانية ، مما يؤدي إلى تضخيم انتقائي لتسلسلات جينية معينة. يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل أكثر حساسية وتحديدا من تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي ويستخدم على نطاق واسع كتقنية للكشف عن الأمراض المختلفة.

البروتوكول

1. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي الفيروسي

1. قم بإزالة كواشف RT المدرجة في الجدول 1 من الفريزر ، واحتفظ بها على الجليد ، وقم بإذابة الثلج ودوامة قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد 12 ميكرولتر من مزيج تفاعل RT في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 0.2 مل مع الكواشف المدرجة في الجدول 1. اسمح باختلافات سحب العينات عن طريق تحضير حجم من المزيج الرئيسي بحجم تفاعل واحد على الأقل أكبر من المطلوب.
3. أضف عينة 8 ميكرولتر أو RNA للتحكم الإيجابي أو التحكم السلبي إلى مزيج تفاعل RT داخل محطة عمل PCR في غرفة القوالب. التحكم الإيجابي RT هو الحمض النووي الريبي المستخرج من مزرعة الخلية المصابة بسلالة RABV الثابتة CVS-11 (معيار فيروس التحدي -11) ويتم تخزينها عند -80 درجة مئوية. يحتوي عنصر التحكم السلبي على ddH₂O الخالي من RNase.
4. امزج محتويات أنابيب RT عن طريق الرأس؛ ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.
5. قم بتحميل أنابيب التفاعل في جهاز تدوير حراري. قم بإعداد برنامج تخليق (كدنا) بالشروط التالية: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 4 درجات مئوية قيد الانتظار. اضبط حجم التفاعل على 20 ميكرولتر. ابدأ تشغيل RT.

2. الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل

1. احتفظ بكواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل المدرجة في الجدول 2 على الجليد في غرفة نظيفة حتى الاستخدام ؛ ثم قم بإذابة الثلج ودوامة.
2. قم بإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجولة الأولى في أنبوب PCR سعة 0.2 مل مع الكواشف المدرجة في الجدول 2.
3. أضف عينة 2 ميكرولتر من (كدنا) أو البلازميد إلى مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل للجولة الأولى داخل محطة عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل في غرفة القوالب. التحكم الإيجابي في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو CVS-11 (كدنا) المحضر كما هو مذكور في الخطوة 1.3 لطريقة RT المذكورة أعلاه. التحكم السلبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو dd H₂O.
4. انقل الأنابيب المختومة إلى جهاز تدوير حراري PCR وقم بدورته باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 3.

< p class = "jove_title" >3. الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل

1. قم بإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجولة الثانية في أنبوب PCR سعة 0.2 مل باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4.
2. أضف 2 ميكرولتر من منتج PCR الجولة الأولى إلى مزيج PCR في الجولة الثانية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين dd H₂O كتحكم سلبي في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
3. قم بإجراء التدوير الحراري PCR باستخدام نفس المعلمات الموضحة في الخطوة 2.4.

الجدول 1: كواشف النسخ العكسي لتخليق (كدنا

). مكون الحجم لكل تفاعل (ميكرولتر) dNTPs (2.5 ملليمتر) 4 التمهيدي العشوائي (50 ميكرومتر) 1.5 أوليغو (dT) 15 (50 ميكرومتر) 0.5 المخزن المؤقت M-MLV (5x) 4 النسخ العكسي M-MLV (200 وحدة دولية / ميكرولتر) 1 RNasin (40 وحدة دولية / ميكرولتر) 1 الحجم الإجمالي 12

الجدول 2: كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجولة الأولى.

مكون الحجم لكل تفاعل (ميكرولتر) dNTPs (10 ملليمتر) 1 Ex-Taq (5 U / μL) 0.3 طاق عازلة (10x) 5 N127 (20 ميكرومتر) 1 N829 (20 ميكرومتر) 1 د ح₂س 39.7 [إ] الحجم الإجمالي 48

الجدول 3: معلمات ركوب الدراجات في الجولة الأولى والثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل

درجة الحرارة الوقت دور 94 درجة مئوية 2 دقيقة 1 94 درجة مئوية 30 ثانية 35 56 درجة مئوية 30 ثانية 35 72 درجة مئوية 40 ثانية 35 72 درجة مئوية 10 دقائق 1 4 درجة مئوية ∞

الجدول 4: كواشف الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

مكون الحجم لكل تفاعل (ميكرولتر) dNTPs (10 ملليمتر) 1 Ex-Taq (5 U / μL) 0.3 طاق عازلة (10x) 5 N371F (20 ميكرومتر) 1 N371R (20 ميكرومتر) 1 د ح₂س 39.7 [إ] الحجم الإجمالي 48

المواد