مقالة منهجية

تفاعل البوليميراز المتسلسل ذوبان عالي الدقة لتحديد اختلافات التسلسل في تسلسلات الحمض النووي الطافرة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kisserli, A., et al. تفاعل البوليميراز المتسلسل ذوبان عالي الدقة للتنميط الجيني لتعدد الأشكال بطول مستقبلات المكملة: أداة مبتكرة لتقييم القابلية للجينات لمرض الزهايمر. J. Vis. Exp. (2017).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الذائب عالية الدقة لتحديد تعدد الأشكال لطول شظايا الحمض النووي بأطوال تسلسل متفاوتة ، بناء على تحليل درجة حرارة الانصهار.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بروتوكول HRM-PCR

  1. قم بإذابة عينات الحمض النووي. قم بتخفيف عينات الحمض النووي في أنابيب سعة 1.5 مل بالماء لضبطها على تركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر < br / > ملاحظه: يجب أن يتراوح الحجم الكلي للحمض النووي المخفف بين 2 ميكرولتر و 10 ميكرولتر.
  2. قم بإذابة المحاليل التمهيدية. قم بتخفيف المحاليل الأولية في أنابيب سعة 1.5 مل بالماء لضبطها على نفس تركيز 6 ميكرومتر < br / > ملاحظه: يتم توفير التسلسلات التمهيدية وظروف التفاعل في الجدول 1.
  3. قم بإذابة حلول مجموعة HRM-PCR واخلطها بعناية عن طريق الدوامة لضمان استعادة جميع المحتويات. قم بتدوير القوارير الثلاثة التي تحتوي على الخليط الأنزيمي لفترة وجيزة مع صبغة ربط الحمض النووي ، MgCl2 ، والماء في جهاز طرد مركزي دقيق قبل فتحها. قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. في أنبوب سعة 1.5 مل في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد مزيج PCR لتفاعل واحد 20 ميكرولتر عن طريق إضافة المكونات التالية بالترتيب المذكور أدناه:
    1. 10 ميكرولتر من الخليط الأنزيمي مع صبغة ربط الحمض النووي ؛
    2. 2 ميكرولتر من 25 ملي ملغ كلوريد2 ؛
    3. 1 ميكرولتر من التمهيدي 1 ، 6 ميكرومتر (التركيز النهائي: 300 نانومتر) ؛
    4. 1 ميكرولتر من التمهيدي 2 ، 6 ميكرومتر (التركيز النهائي: 300 نانومتر) ؛ و
    5. 5 ميكرولتر من الماء < / > ملاحظه: لتحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل لأكثر من تفاعل واحد، اضرب الأحجام أعلاه في عدد التفاعلات المراد تشغيلها، بالإضافة إلى تفاعل إضافي واحد.
  5. تخلط بعناية عن طريق الدوامة.
  6. ماصة 19 ميكرولتر من مزيج PCR ، المحضر أعلاه ، في كل بئر من صفيحة بيضاء متعددة الآبار.
  7. أضف 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي المعدل حسب التركيز.
    ملاحظه: بالنسبة لتفاعلات التحكم ، قم دائما بتشغيل عنصر تحكم سلبي مع العينات. لإعداد عنصر تحكم سلبي ، استبدل قالب الحمض النووي بالماء.
  8. أغلق اللوحة البيضاء متعددة الآبار بورق مانع للتسرب.
  9. ضع اللوحة البيضاء متعددة الآبار في جهاز الطرد المركزي ووازنها بثقل موازن مناسب (أي لوحة أخرى متعددة الآبار). جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1,500 × جم في جهاز طرد مركزي قياسي ذو دلو متأرجح يحتوي على دوار للألواح متعددة الآبار مع محولات مناسبة.
  10. قم بتحميل اللوحة البيضاء متعددة الآبار في أداة HRM-PCR.
  11. ابدأ برنامج HRM-PCR بشروط PCR التالية:
    التمسخ: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 1 دورة < / > التضخيم: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 47 دورة.
    منحنى الانصهار: 95 درجة مئوية ؛ معدل المنحدر: 0.02 درجة مئوية / ثانية ؛ 25 عملية استحواذ لكل درجة مئوية ؛ 1 دورة < / > التبريد: 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ معدل المنحدر 2.2 درجة مئوية / ثانية ؛ 1 دورة.
< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-protocol-1

الجدول 1: الابادات والمعلمات المستخدمة في تحليل الذوبان عالي الدقة.

2. تحليل إدارة الموارد البشرية لتحديد تعدد الأشكال لطول CR1

ملاحظة: المنهجية الموضحة (الشكل 1) خاصة ببرنامجنا (انظر جدول المواد)، على الرغم من أنه يمكن استخدام حزم برامج أخرى.

  1. افتح برنامج مسح الجينات لإجراء تحليل مسح تعدد الأشكال بطول CR1.
  2. افتح التجربة التي تحتوي على برنامج التضخيم وبرنامج منحنى الذوبان.
  3. انقر فوق محرر العينة في شريط الوحدة النمطية ثم حدد سير عمل المسح.
  4. تحديد خصائص العينات (أي الاسم ؛ التحكم غير المعروف أو السلبي).
  5. انقر فوق تحليل في شريط الوحدة النمطية.
  6. في القائمة إنشاء تحليل جديد، حدد المسح الجيني.
  7. انقر فوق علامة التبويب التسوية لتطبيع منحنيات الذوبان.
  8. انقر فوق علامة التبويب "إزاحة درجة الحرارة" لإعادة ضبط محور درجة الحرارة (المحور السيني) لمنحنيات الانصهار.
    ملاحظه: يوضح الرسم البياني السفلي منحنيات الذوبان التي يتم تطبيعها وتغيير درجة الحرارة.
  9. انقر فوق الزر "حساب" لتحليل النتائج وتحديد التجميع.
  10. انقر فوق علامة التبويب مخطط الفرق في منطقة المخططات لعرض منحنيات الذوبان الطبيعية والمحولة ومخطط الفرق الطبيعي ودرجة الحرارة المتغيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: لقطات شاشة للواجهة الرسومية للبرنامج المستخدم في الخطوة 2 من البروتوكول. (أ) افتح برنامج مسح الجينات. (ب) برنامج التضخيم وبرنامج منحنى الذوبان. (ج) انقر فوق محرر العينة في شريط الوحدة النمطية. (د) حدد مسح ضوئي. (ه) تحديد خصائص العينات. (و) انقر فوق التحليل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معطف المختبر حماية قفازات فحص النتريل الخالية من مسحوق SensiCareIce شركة Medline Industries، Inc ، Mundelein ، IL 60060 ، الولايات المتحدة الأمريكية 486802 حماية العينة ماصة Eppendorf Reference 2 ، 0.5-10 ميكرولتر Eppendorf France SAS ، F-78360 مونتيسون ، فرنسا 4920000024 عينة سحب العينة ماصة Eppendorf Reference 2 ، 20-100 ميكرولتر Eppendorf France SAS ، F-78360 مونتيسون ، فرنسا 4920000059 عينة سحب العينة ماصة Eppendorf Reference 2 ، 100-1000 ميكرولتر Eppendorf France SAS ، F-78360 مونتيسون ، فرنسا 4920000083 عينة سحب العينة TipOne 10 ميكرولتر متخرج ، طرف مرشح Starlab GmbH ، D-22926 Ahrenburg ، ألمانيا S1121-3810 عينة سحب العينة TipOne 1-100 ميكرولتر مشطوف ، طرف مرشح Starlab GmbH ، D-22926 Ahrenburg ، ألمانيا S1120-1840 عينة سحب العينة تلميح حاجز ART 1000E ثيرمو فيشر العلمي ، F-67403 Illkirch ، فرنسا 2079 ه عينة سحب العينة أنابيب القفل الآمن من Eppendorf ، 1.5 مل ، جودة Eppendorf Eppendorf France SAS ، F-78360 مونتيسون ، فرنسا 30120086 خلط دوامة الجني 2 الصناعات العلمية ، شركة ، بوهيميا ، نيويورك 111716 ، الولايات المتحدة الأمريكية SI-0236 خلط جهاز طرد مركزي Mikro 200 Hettich Zentrifugen ، D-78532 ، ألمانيا 0002020-02-00 الطرد المركزي مضاعفة E3 Eppendorf France SAS ، F-78360 مونتيسون ، فرنسا 4987000010 توزيع لايت سايكل 480 لوحة متعددة الآبار 96 ، أبيض Roche Diagnostics GmbH ، D-68305 مانهايم ، ألمانيا 4729692001 مكان رد الفعل ضوء Cycler 480 رقائق الختم Roche Diagnostics GmbH ، D-68305 مانهايم ، ألمانيا 4429757001 تغطيه LightCycler 480 Instrument II ، 96 بئر Roche Diagnostics GmbH ، D-68305 مانهايم ، ألمانيا 05015278001 تفاعل البوليميراز المتسلسل ذوبان عالي الدقة جهاز طرد مركزي Heraeus Megafuge 11R ثيرمو فيشر العلمي ، F-67403 Illkirch ، فرنسا 75004412 الطرد المركزي LightCycler 480 ماجستير ذوبان عالي الدقة Roche Diagnostics GmbH ، D-68305 مانهايم ، ألمانيا 04909631001 كواشف التفاعل التمهيدي CN3: 5'ggccttagacttcctgc 3' قسم Eurogentec Biologics ، B4102 Seraing ، بلجيكا كاشف التفاعل CN3re التمهيدي: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' قسم Eurogentec Biologics ، B4102 Seraing ، بلجيكا كواشف التفاعل برنامج Cycle 480 SW 1.5.1 Roche Diagnostics GmbH ، D-68305 مانهايم ، ألمانيا البرنامج المستخدم لتحليل بيانات تعدد الأشكال HRM-PCR CR1

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA PCR DNA CR1

مقالات ذات صلة