تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد القطرات للكشف عن مثيلة الحمض النووي في الكريات البيض

الملخص

المصدر: ماليك، إل.، وآخرون. مثيلة محددة متعددة الإرسال قطرة PCR باستخدام جهاز مولد قطرات البوليمر لتشخيص الدم.J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال للقياس الكمي المتزامن لمناطق الحمض النووي الميثيلية في مجموعات مختلفة من خلايا الدم البيضاء كمؤشر حيوي مبكر للتشخيص السريري والتشخيص.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد القطرات و PCR

ملاحظة: يوضح الجدول 1 معلومات حول البادئات الأمامية والعكسية جنبا إلى جنب مع مجسات التحلل المائي المروية المزدوجة لجينات C-LESS و CD3Z و Foxp3 ، وهي مطلوبة للتضخيم المتعدد لأهداف الجينات منزوعة الميثيل.

1. قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 2.
2. قم بإذابة جميع مكونات المزيج الرئيسي باستثناء مزيج الإنزيم. امزج المزيج الرئيسي جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى لأسفل ، ثم قم بالتدوير لأسفل لفترة وجيزة.
3. أضف الحجم المناسب (1 ميكرولتر) من الحمض النووي المحول بثنائي الكبريتيت إلى المزيج الرئيسي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). امزج التفاعل عن طريق سحب الماصة لأعلى لأسفل والدوران لأسفل لفترة وجيزة.
4. قم بتوصيل الأنابيب السائلة التي تستخدم لمرة واحدة (معرف 0.25 مم ، OD 1.6 مم) بحقنتين زجاجيتين دقيقتين (حجم 250 ميكرولتر) باستخدام تركيبات PEEK.
5. املأ مسبقا حقنة زجاجية دقيقة واحدة ب 250 ميكرولتر من الزيت الناقل الذي يحتوي على 5٪ مادة خافضة للتوتر السطحي بالفلور.
6. قم بتعبئة حقنة زجاجية دقيقة أخرى ب 50 ميكرولتر من الزيت الناقل قبل تحميل 100 ميكرولتر من مزيج PCR لضمان توزيع حجم العينة بالكامل أثناء الاستحلاب.
7. قم بإعداد جهاز ميكروفلويد قطرات على مسرح مجهر ضوئي عمودي مزود بكاميرا عالية السرعة لمراقبة وتسجيل تكوين القطرات في الوقت الفعلي.
8. ضع المحاقن المعبأة مسبقا على مضخة الحقنة القابلة للبرمجة وباستخدام اتحاد PEEK مع التركيبات (انظر جدول المواد) ، قم بتوصيل أنبوب المحاقن بأنابيب قنوات المدخل الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة بالقطرات.
9. ضع الأنبوب من مخرج مولد القطرات داخل أنبوب PCR سعة 0.5 مل.
10. اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة على 2 ميكرولتر / دقيقة واترك حجم القطرة يستقر قبل جمع المستحلب الناتج.
11. اجمع المستحلب وانقل 75 ميكرولتر إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل للدورة الحرارية.
12. تأكد من أن محتوى الزيت في أنبوب PCR يتطابق بشكل وثيق مع حجم المرحلة المشتتة من أجل منع اندماج القطرات أثناء الدوران الحراري.
13. ضع أنبوب PCR سعة 0.2 مل في جهاز تدوير حراري وقم بإجراء بروتوكول التدوير على النحو التالي: التسخين المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 45 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

الجدول 1: تصميم مسبار التمهيدي والتحلل المائي.

FOXP3 إلى الأمام GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG عكس FOXP3 TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA CD3Z إلى الأمام GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG عكس CD3Z CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA C-LESS إلى الأمام TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA C-LESS عكس TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C C مسبار FOXP3 /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ مسبار CDZ3 /56-سداسي عشري/سم مكعب AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ مسبار C-Less /56-CY5 / CT CCC CCT C / ZEN / T AAC TCT at / 3IABkFQ /

الجدول 2: وصفة المزيج الرئيسية ل mdPCR.

الكاشف حل المخزون حجم المزيج الرئيسي تركيز العمل تريس حمض الهيدروكلوريك 1 م 2 ميكرولتر 20 ملم كيه سي إل 1 م 10 ميكرولتر 100 ملم مغنكلوريد₂ 25 ملم 16 ميكرولتر 4 مللي برايمر C-LESS 10 ميكرومتر 10 ميكرولتر 1 ميكرومتر لكل منهما بادئات CD3Z 10 ميكرومتر 10 ميكرولتر 1 ميكرومتر لكل منهما FOXP3 برايمر 10 ميكرومتر 10 ميكرولتر 1 ميكرومتر لكل منهما مسبار C-LESS 10 ميكرومتر 5 ميكرولتر 500 نانومتر مسبار CD3Z 10 ميكرومتر 5 ميكرولتر 500 نانومتر مسبار FOXP3 10 ميكرومتر 5 ميكرولتر 500 نانومتر HotStarTaq DNA Polymerase 5 وحدات / ميكرولتر 8 ميكرولتر 0.4 وحدة / ميكرولتر هدف الحمض النووي المعالج بثنائي الكبريتيت متغير متغير متغير مياه خالية من النوكلياز متغير الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب PCR بيو راد ، ميسيسوجا ، أونتاريو TFI0201 الفلورو السطحي RAN Biotechnologies ، بيفرلي ، ماساتشوستس 008-الفلورو الفاعل بالسطح أنابيب السوائل التي يمكن التخلص منها الدولوميت 3200063 أنابيب السوائل التي يمكن التخلص منها الدولوميت 3200302 تجهيزات نظرة خاطفة آيدكس للصحة والعلوم ، أوك هاربور ، واشنطن ف -881 زيت الناقل 3M ، سانت بول ، مينيسوتا مجهر ضوئي مستقيم نيكون ، ميلفيل ، نيويورك