$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
p class = "jove_title" >1. مراقبة جودة الحمض النووي الجيني
ملاحظة: تم استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA) من الدم المحيطي باستخدام طريقة تنقية الحمض النووي القائمة على غشاء السيليكا الراسخة. قبل الإجراءات أدناه ، تم تحديد تركيز gDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- تحضير عينة gDNA بتركيز 10-100 نانوغرام / ميكرولتر.
- أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة الحمض النووي إلى شريط مكون من 8 أنابيب.
- أضف 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي أو gDNA إلى الأنابيب. دوامة الخليط لمدة 1 دقيقة باستخدام ملحق الصفيحة الدقيقة.
- قم بتحميل الأنبوب وجهاز الهلام وأطراف الماصة في أداة الرحلان الكهربائي (جدول المواد) وابدأ التشغيل بالضغط على زر "ابدأ".
ملاحظه: سيعمل نظام الرحلان الكهربائي تلقائيا بنقرة واحدة على زر البدء.
- تأكد من تعيين العلامة السفلية الموجودة في المخزن المؤقت لعينة الحمض النووي بشكل صحيح على المخططات الكهربية. إذا تم تعيينه بشكل غير صحيح ، فقم بتعيين العلامة يدويا في "وضع التمثيل الكهربائي" للبرنامج.
ملاحظه: سيتم حساب رقم سلامة الحمض النووي (DIN) تلقائيا. تأتي قيمة DIN من سلامة الحمض النووي. تشير قيم DIN العالية والمنخفضة إلى أن gDNA سليم للغاية ومتدهور بشدة ، على التوالي.
- حدد منطقة حجم gDNA (> 200 نقطة أساس) في "وضع المنطقة" للبرنامج لحساب تركيز gDNA تلقائيا (> 200 نقطة أساس).
2. تصميم التمهيدي والمسبار
- احسب قيم درجة حرارة الانصهار (Tm) باستخدام أي أداة وصول مفتوح في ظل الظروف التالية: 10-25 قاعدة ، و 50 ملي مولار Na + / K + ، و 0.80 ملي مولار dNTPs ، و 3 ملي مولار ملغ2+ (جدول المواد). صمم البادئات الأمامية والخلفية لتضخيم المنطقة الجينومية التي تحتوي على الأليلات المستهدفة بقيمة Tm حوالي 60 درجة مئوية وطول الأمبليكون عند 100-300 نقطة أساس.
ملاحظة: راجع الجدول 1 لمعرفة تركيز قليل النوكليوتيدات.
- تصميم مجسات الحمض النووي المقفل (LNA) للأليلات المرجعية والمتغيرة بناء على الشروط التالية: (أنا) 1-6 LNAs موجودة في كل مسبار. (ii) توجد صبغة فلورية ومروي في النهايات 5 'و 3' لكل مسبار ، على التوالي ؛ (3) الفرق بين قيم Tm للمجسات المتطابقة وغير المتطابقة > 10 درجات مئوية ؛ (iv) قيم Tm للمجسات المتطابقة وغير المتطابقة أعلى وأقل من قيم البادئات ، على التوالي [على سبيل المثال ، التمهيدي الأمامي: 60.8 درجة مئوية ، التمهيدي العكسي: 59.8 درجة مئوية ، مسبار الأليل المرجعي (متطابق / غير متطابق): 62.6 / 45.3 درجة مئوية ، مسبار الأليل المتغير (متطابق / غير متطابق): 61.7 / 50.5 درجة مئوية]. تم حساب قيم Tm باستخدام أداة الوصول المفتوح المستخدمة أيضا للخطوة 2.1.
- تأكد من أن البادئات والمجسات المصممة لا تشمل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة بتردد > 0.1٪ كما هو محدد من قواعد البيانات [على سبيل المثال ، قاعدة بيانات تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (dbSNP)].
3. تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي
- قم بإعداد البادئات والمجسات ومحاليل مخزون gDNA بالتركيزات الموضحة في الجدول 1 باستخدام مخزن مؤقت TE وتخزينها عند -20-4 درجة مئوية.
- امزج الكواشف في درجة حرارة الغرفة بحجم إجمالي قدره 15 ميكرولتر إلى تركيز نهائي كما هو موضح في الجدول 1.
- أضف 3 ميكرولتر من الماء المقطر بدلا من gDNA في عنصر تحكم بدون قالب (NTC).
- قم بإعداد 3.5 أضعاف كمية خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل ثلاث نسخ لحساب خطأ سحب العينات.
- قم بتقطيع خليط PCR لأعلى ولأسفل لخلطه.
- اضبط منصة التحميل على الرقائق المدمجة في الشريط المكون من 8 أنابيب واضبطها على اللودر التلقائي. تأكد من وجود اتصال بين الرقاقة ومنصة التحميل.
- قم بتركيب شريط تمرير التحميل على المنصة واضغط مع استمرار شريط التمرير مع إيقاف تشغيل السدادة من اللودر.
- الماصة 15 ميكرولتر من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل على المنصة بالقرب من طرف شريط التمرير (الشكل 1 أ).
- قم بتشغيل اللودر بالضغط على زر اللودر (لمدة 1 دقيقة تقريبا).
ملاحظه: لا توجد مشكلة إذا بقيت كمية صغيرة من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل على المنصة. من الممكن إعادة تشغيل المحمل بالتسلسل.
- ضع الرقاقة في الأنبوب المملوء بخليط PCR في الفتحة الجانبية لمحسن الختم. ادفع غطاء المنزلق وحافة الغطاء العلوي حتى لا تكسر الرقاقة (الشكل 1 ب).
- قم بتشغيل محسن الختم (حوالي 2 دقيقة). أعد تشغيل محسن الختم بالتتابع لمدة 1 دقيقة إذا كانت بركة من السائل لا تزال مرئية لأن الختم غير المكتمل يتسبب في تلوث متبادل للإشارات الإيجابية (الشكلان 1C و 1D).
- أضف 230 ميكرولتر من سائل الختم ، وهو كاشف زيتي ، إلى الأنابيب.
ملاحظه: يجب الآن غمر الرقائق في السائل.
- اضبط الأنابيب في الدراجة الحرارية. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2 (لمدة 2 ساعة تقريبا). اضبط درجة الحرارة أو مدة تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا كان هناك توزيع غير متساو للأقسام الموجبة (الشكل 1E).
ملاحظة: يوصى بضبط معدل المنحدر على حوالي 1 درجة مئوية / ثانية.
- اترك الأنابيب في جهاز التدوير الحراري لمدة 15 دقيقة على الأقل لتقليل ضوضاء خط الأساس.
ملاحظه: يمكن ترك الأنابيب بين عشية وضحاها أيضا. تم الكشف عن إشارات التألق حتى في اليوم التالي.
- اضبط الأنابيب على رقصة الكشف واسكب 6 مل من الماء المقطر في الرقصة. إذا كانت فقاعات الهواء مرئية داخل وخارج الأنابيب ، فقم بإزالتها (الشكلان 1F و 1G).
- قم بتحميل الرقصة في الكاشف وقم بتشغيلها بنقرة واحدة على زر "تشغيل" للبرنامج بعد تحديد علامات التبويب Fluorescence و Experiment و Sample / NTC (جدول المواد).
ملاحظة: يستغرق اكتشاف الألوان المزدوجة لثماني عينات ذات كثافة افتراضية حوالي 4 - 5 دقائق.
- قم بتأكيد مخطط الموضع والرسم البياني ومخطط مبعثر ثنائي الأبعاد.
ملاحظة: إذا كانت شدة التألق للأقسام السالبة عالية ، فاضبط الكثافة بنقرة واحدة على زر الإعدادات في البرنامج بحيث يقع في نطاق 30-70.
- احسب جزء الأليل المتغير (VAF) باستخدام الصيغة التالية:
هنا ، Cv و Cr هما أرقام نسخ المتغير والأليل المرجعي ، على التوالي.
ملاحظه: يتم حسابها تلقائيا في البرنامج بناء على إحصائيات بواسون.
فئة
4. مجموعة منتجات PCR
- قم بإزالة سائل الختم من الأنبوب.
- أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى الأنبوب. دوامة بقوة لمدة 30 ثانية ولفترة وجيزة الطرد المركزي الأنبوب.
- انقل محلول TE إلى أنبوب آخر وأضف 30 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M و 200 ميكرولتر من الإيثانول.
- قم بتبريد المحلول عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
- قم بالطرد المركزي للمحلول لمدة 30 دقيقة عند 16,000 × جم وقم بإزالة المادة الطافية.
- أضف 300 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول إلى الأنبوب والدوامة.
- الطرد المركزي المحلول لمدة 15 دقيقة عند 16,000 × جم وإزالة المادة الطافية. اترك الراسب يجف في الهواء لمدة 5 دقائق.
- قم بإذابة الراسب في 1-5 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE بعد التجفيف بالهواء.
- إذا لزم الأمر ، قم بتقييم حجم المنتج باستخدام أداة الرحلان الكهربائي مع الإشارة إلى الخطوة 1. قم بتحميل 1 ميكرولتر من المحلول على جهاز الجل للحصول على حساسية عالية (جدول المواد).
