تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الرقاقة للكشف عن متغيرات النسخ النادرة باستخدام شريحة نانو فلويد

Abstract

المصدر: Molinari, C., et al. الكشف عن متغير نسخة نادرة CDH1 في أنسجة سرطان المعدة المجمدة حديثا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الرقاقة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الرقاقة - وهو نوع مختلف من تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية المفيدة في اكتشاف متغيرات النسخ النادرة. يتم تقسيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى غرف رقاقة نانوية ، يعمل كل منها كتفاعل مستقل. يؤكد اكتشاف إشارات التألق من الغرف ذات الأهداف المضخمة وجود متغيرات نادرة في النسخ في العينة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

ملاحظة: تم تصميم هذا الإجراء خصيصا للكشف عن عدد قليل من جزيئات (كدنا) في الأنسجة البشرية المجمدة الطازجة. تم قطع أقسام الأنسجة على الثلج الجاف ، بينما لا تزال مجمدة ، من ورم المعدة المشتق من المريض أو عينات الأنسجة الطبيعية التي تم التحقق من صحتها مسبقا.

فئة

1. عزل وتنقية الحمض النووي الريبي

1. استخراج الحمض النووي الريبي
   ملاحظه: يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي تحت غطاء المحرك باستخدام منتج معين (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، تتوفر مجموعة متنوعة من مجموعات العزل تجاريا.
   قم
   1. بتجانس 50-100 مجم من عينة الأنسجة المجمدة الطازجة المقطوعة بدقة في أنبوب سعة 1.5 مل مع 1 مل من كاشف عزل الحمض النووي الريبي والدوامة بقوة لمدة 15 ثانية.
   2. احتضان الأنبوب الذي يحتوي على العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية.
   3. احتفظ بالأنبوب على الجليد ، وأضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ودوامة بقوة لمدة 15 ثانية.
   4. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ثانية وقم بطردها عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. انقل المرحلة المائية إلى أنبوب سعة 1.5 مل وأضف 20 ميكروغرام من الجليكوجين.
      ملاحظه: من المهم تجنب نقل أي من الطور البيني أو الطبقات العضوية بعناية من أجل تقليل التلوث.
   6. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، واقلب الأنبوب للخلط ، واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
   7. الطرد المركزي الأنبوب عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب الحمض النووي الريبي.
      ملاحظه: سيكون الحمض النووي الريبي موجودا في حبيبات تشبه الهلام على جانب وأسفل الأنبوب ، وغالبا ما تكون غير مرئية بعد الطرد المركزي.
   8. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الراسب واغسله ب 1 مل من 75٪ من الإيثانول عن طريق سحب العينات.
   قم
   9. بالطرد المركزي للأنبوب عند 7,500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
   10. دع الحبيبات تجف حتى يصبح الراسب شفافا وقم بإذابته في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
   11. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية طوال الليل على الأقل قبل القياس الكمي.
2. القضاء على الحمض النووي الجيني وتنقية الحمض النووي الريبي
   ملاحظه: يوصى باستخدام خطوة هضم DNase ، متبوعة بتنقية الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود ، لتحليل الأهداف منخفضة الوفرة من أجل هضم الحمض النووي الملوث.
   1. قم بإذابة DNase I المجفف بالتجميد (1,500 وحدة Kunitz) في 550 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase باستخدام حقنة ، واخلطها برفق عن طريق قلب القارورة ، وقسم محلول المخزون المعاد تكوينه إلى حصص.
   2. انقل الحجم المحسوب للعينة في أنبوب 1.5 مل مع 15 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم DNase من المجموعة (المدرجة في جدول المواد) ، و 2.5 ميكرولتر من محلول مخزون DNase I ، والماء الخالي من RNase إلى 100 ميكرولتر.
   3. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة (من المجموعة، انظر جدول المواد) واخلطه عن طريق سحب العينات.
   4. أضف 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ واخلطها عن طريق سحب العينات.
   5. انقل الحجم بأكمله (700 ميكرولتر) إلى عمود دوران جديد وجهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 ثانية.
   6. انقل الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد ، وأضف 500 ميكرولتر من 80٪ إيثانول إلى العمود ، وجهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة دقيقتين.
   7. افتح غطاء عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام أنبوب تجميع جديد لتجفيف الفلتر ؛ ثم انقل الفلتر إلى أنبوب 1.5 مل.
   8. أضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى عمود المرشح وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة دقيقة واحدة.
   9. احتفظ بالعينات على الجليد وانتقل إلى القياس الكمي باستخدام 2 ميكرولتر من العينة على مقياس الطيف الضوئي العلوي أو قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي

1. مزيج تفاعل dPCR وتحضير العينة
   1. قم بإذابة المزيج الرئيسي والمقايسة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   2. تمييع عينات (كدنا) إلى تركيز 300 نانوغرام في 6 ميكرولتر من الماء.
   قم
   3. بدوامة المزيج الرئيسي برفق وقم بإعداد المزيج في أنبوب معقم مع 8.7 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 0.87 ميكرولتر من برايمر الفحص CDH1a المصمم خصيصا ، و 1.83 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز للحصول على حجم نهائي يبلغ 11.4 ميكرولتر
      ملاحظه: للحصول على تفاصيل التمهيدي للفحص CDH1a المصممة خصيصا ، راجع جدول المواد.
   4. انقل 11.4 ميكرولتر من المزيج المحضر إلى عينة (كدنا) المخففة ، واخلطها برفق ، ولفترة وجيزة جهاز طرد مركزي.
      ملاحظه: تشتمل الأحجام على زيادة بنسبة 20٪ للتعويض عن فقد الحجم الناتج عن سحب العينات. قم بإعداد المزيج لجميع العينات وعنصر تحكم بدون قالب (NTC).
2. تحضير الرقائق
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحميل الرقائق في أسرع وقت ممكن.
   1. قم بتوصيل محمل الشريحة وانتظر حتى يتحول ضوء المؤشر إلى اللون الأخضر.
   2. قم بإزالة غطاء حقنة سائل الغاطس عن طريق سحب المكبس برفق للخلف 1-2 مم وتحريره لتسهيل هذه الخطوة ، واستبدله بطرف.
   3. خذ شريحة جديدة ولاحظ الكود المكتوب على الغطاء لربطه بالعينة.
   4. أمسك الغطاء بعناية من جانبه ، وانزع الفيلم الواقي ، ثم ضع الغطاء مع الوجه اللاصق لأعلى في الاتجاه الصحيح.
   5. التقط شريحة بعناية ، مع الحرص على عدم لمس الجزء الداخلي ، وقم بتحميلها على عش الرقائق في الموضع الصحيح عن طريق الضغط على الرافعة لفتح المشبك.
   6. قم بتحميل شفرة تحميل جديدة على اللودر وادفعها برفق للتأكد من ثباتها في مكانها.
   7. انقل 14.5 ميكرولتر من مزيج تفاعل dPCR على شفرة التحميل دون عمل فقاعات هواء أو انحراف الشفرة ، وبعد ذلك اضغط على زر التحميل الأسود لتوزيع مستوى الصوت على الشريحة.
   8. استخدم حقنة سائل الغاطس لنقل حوالي 20 قطرة على سطح الرقاقة مع الحرص على عدم لمس السطح بالحافة.
      ملاحظه: من المهم تغطية السطح بالكامل دون سكب السوائل على الحواف.
   9. قم بتدوير ذراع اللودر لجعل الغطاء يتلامس مع الرقاقة واضغط لأسفل لمدة 15 ثانية.
   10. اضغط على زر الغطاء لتحرير الرقاقة وإعادة الذراع إلى موضعها.
   11. أمسك الشريحة المجمعة بزاوية 45 درجة وقم بتوزيع سائل الغمر بعناية مع المحقنة من خلال منفذ التعبئة ، وقم بتدوير الشريحة قليلا للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء ، وقم بإزالة أي سائل زائد بمنديل معقم.
   12. أغلق علبة الرقائق عن طريق تقشير الملصق برفق أعلى غطاء الشريحة واضغط فوق منفذ التعبئة لمدة 5 ثوان على الأقل.
   13. قم بتخزين الرقاقة في الظلام حتى تصبح جاهزة للتحميل في الدراجة الحرارية.
       ملاحظه: يجب استخدام الرقائق المحضرة في غضون 2 ساعة.
3. تفاعل dPCR
   1. افتح الغطاء وقم بتثبيت المحولات على كلتا الكتلتين ، حتى عند استخدام كتلة واحدة.
   2. ضع الرقائق على كتلة العينة في الموضع الصحيح.
      ملاحظه: يجب توجيه منفذ التعبئة نحو مقدمة جهاز التدوير الحراري في وضع مرتفع للسماح لأي فقاعات هواء بالطفو إلى الأعلى دون إزعاج نافذة الشريحة. استخدم رقائق فارغة لموازنة الكتلتين.
   3. ضع الوسادة الحرارية على كتلة العينة لتغطية الرقائق بالكامل.
   4. أغلق الغطاء وابدأ تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع تطبيق الشروط التالية: استمر في 96 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 45 دورة من 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين و 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ استمر في 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ استمر في 4 درجات مئوية. قم بإيقاف تشغيل جهاز التدوير الحراري وإذابة الرقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل < / > ملاحظه: يجب إجراء تحليل الرقاقة في غضون ساعة واحدة.
4. تحليل الرقاقة
   1. افتح غطاء الجهاز وقم بإزالة الوسادات الحرارية ، ثم قم بإزالة الرقائق من المحولات.
      ملاحظه: قم بتخزين الرقائق في مكان مظلم ونظيف حتى التحليل.
   2. نظف سطح الرقاقة بالأيزوبروبانول ومنديل معقم.
      ملاحظه: افحص كل شريحة بحثا عن التسريبات أو المشاكل المحتملة.
   3. أدخل USB في نظام الكاشف لحفظ البيانات.
   4. افتح صينية الشرائح الخاصة بنظام الكاشف ، وقم بتحميل الشريحة في الموضع الصحيح ، ثم أغلق الدرج.
   5. انتظر لمدة 30 ثانية للمعالجة ، ثم قم بإزالة الشريحة وأدخل الشريحة التالية.
   6. انتظر حتى يكتمل التحليل لجميع الرقائق التي تمت معالجتها ثم أدخل USB في جهاز كمبيوتر لنقل الملفات.
      ملاحظه: الوقت الإجمالي للتحليل حوالي 2 إلى 3 دقائق / شريحة.

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات وتفسيرها

1. اتصل بالنظام الأساسي للبرامج المستندة إلى السحابة المطلوب لإجراء جميع التحليلات النهائية
2. قم بإنشاء مشروع واستيراد جميع ملفات البيانات الخاصة بالرقائق ذات الأهمية.
3. أدخل اسم العينة ؛ حدد الصبغة والمقايسة المستخدمة في علامة التبويب "تعريف الرقائق".
4. حدد ما إذا كانت الشريحة مقبولة من خلال تصورها في علامة التبويب "مراجعة البيانات" ، والتحقق من مدى دقة تحميل العينة على الشريحة وعدد نقاط البيانات التي يمكن تقييمها.
   ملاحظه: رفض الرقائق التي تحتوي على أقل من 13,000 نقطة بيانات قيمة.
5. انتقل إلى مخطط مبعثر الشريحة المحددة على الجانب الأيمن من الشاشة ؛ قم بتطبيق عتبة 6,000 لإشارات صبغة مراسل الفلوريسين أميديت (FAM) (المحور Y) على جميع الرقائق.
   ملاحظه: قد يختلف إعداد العتبة على أساس المقايسات المستخدمة.
6. قم بإزالة أي إشارات إيجابية مشكوك فيها لمنع النتائج الإيجابية الخاطئة عن طريق تحديد البقعة النسبية على مخطط التبعثر باستخدام أداة lasso والضغط على "غير محدد". تشير جميع البقع الإيجابية المتبقية إلى وجود نسخ (كدنا) للهدف النادر الذي تم تحليله.

Materials