$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. الترتيب المسبق للحيوانات
- قم بوزن الفأر وقم بتحميل الدواء المعني (على سبيل المثال ، القنب ، 5 مجم / كجم من وزن الجسم (BW)) في حقنة الأنسولين. تطبيق الدواء قبل 30 دقيقة من تحريض الجلطة.
- عن طريق إمساك عنق الفأر بين الإبهام والسبابة وذيل الفأر بالإصبع الصغير ، قم بتمديد وحقن الدواء داخل الصفاق (ip) في الربع الأيسر السفلي من البطن. أعد إلى القفص لمدة 15 دقيقة.
- تحضير التخدير بالكيتامين (90 ملغم/كغ وزن الجسم) والزيلازين (25 ملغم/كغ وزن الجسم). قبل 15 دقيقة من تحريض الجلطة، تخدير الفأر. ضع الماوس في القفص ، واسحب الذيل قليلا ، وحقن مخدر ip بحقنة الأنسولين.
- ضع الفأر مرة أخرى في القفص حتى بداية التخدير. للتحقق من التخدير الكافي ، اضغط على الذيل بالملقط.
- قم بتحميل 0.05 مل من ديكستران الفلوريسئين المسام بإيزوثيوسيانات (FITC-dextran؛ 5٪، 150 كيلو دالتون) في حقنة الأنسولين. أثناء ملء المحقنة ، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء ، لأنه حتى فقاعات الهواء الصغيرة التي يتم تناولها عن طريق الوريد (IV) يمكن أن تكون قاتلة للحيوان.
- ضع الماوس المخدر على لوح تسخين في وضع الوجه لأسفل. اضبط لوحة التسخين على 37 درجة مئوية.
- ضع مرهم العين على قرنية الفأر. تطهير الجلد واستخدام أدوات معقمة.
- غرزة خيوط من البولي بروبيلين 7/0 في الحافة القحفية والذيلية للأذن اليمنى. ضع الغرز بالقرب من الحافة وبالقرب من القاعدة قدر الإمكان (الشكل 1 ب).
- قم بتحويل الماوس إلى الوضع الظهري. ثبت جميع الأرجل على منصة زجاج الأكريل باستخدام شرائط لاصقة. قم بربط خياطة تحت الأسنان الأمامية وضع الرأس في الظهر عن طريق لصق الخيط بزجاج الأكريل بشرائط لاصقة.
- نقل على المنصة تحت المجهر المجسم للعملية. استخدم التكبير 16X.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير الوريد الوداجي الأيسر وحقن FITC-dextern
ملاحظة: للفحص المجهري للأذن اليمنى ، قم بإعداد الوريد الوداجي الأيسر.
- باستخدام مشرط ، قم بعمل شق 5 مم في الجلد على الجانب الأيسر من الرقبة في اتجاه قحمي. تشريح الأنسجة تحت الجلد باستخدام الملقط الدقيق والمقص المجهري. إما ربط أوعية العبور بخيوط البوليستر 8/0 أو بالتخثير الكهربائي.
- حرر الوريد من الملقط الدقيق والمقص الدقيق دون لمس الوعاء.
- استخدم حقنة الأنسولين المحضرة لحقن صبغة الفلورسنت. أمسك بعناية جدار الوعاء باستخدام الملقط الدقيق ، دون ثقب الوريد. اخترق جدار الوعاء المنتفخ بالمحقنة وحقن FITC-dextrann IV.
- وقف النزيف بعد سحب المحقنة باستخدام مسحات قطنية. تجنب تلوث الأذن بالدم والصبغة.
فئة
3. وضع الأذن اليمنى للفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية
- انقل الموجود على لوح التسخين إلى هيكل زجاجي أكريل مع فتحة للوحة التسخين ومستوى بارتفاع 0.5 سم لوضع الأذن.
- ثبت ووجهه لأسفل على لوحة التسخين باستخدام شرائط لاصقة. ضع الغضروف القوي والمحدب نسبيا في قاعدة الأذن بجانب الطائرات التي يبلغ ارتفاعها 0.5 سم للأذن (الشكل 1 ب) بحيث يمكن وضع الجزء القمي من الأذن بشكل مسطح على المستوى.
- أضف قطرة واحدة من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى مستوى زجاج الأكريل لوضع الأذن. ضع الأذن اليمنى ، مع الغرز المرتبة مسبقا على جانبها البطني المقعر متجها لأسفل ، عند انخفاض 0.9٪ كلوريد الصوديوم. باستخدام مسحات القطن ، امتصاص قطرة كلوريد الصوديوم واترك القوى الشعرية تربط مستوى الأذن بزجاج الأكريل.
- ألصق الغرز على زجاج الأكريل لإصلاح موضع الأذن.
- أضف قطرة واحدة من 0.9٪ من كلوريد الصوديوم بدرجة حرارة الغرفة إلى الجانب الظهري المحدب من الأذن. ضع بعناية غطاء واحد (قطره 0.5 سم) على الأذن دون ضغط الأوعية القاعدية التي تدخل الأذن. باستخدام مسحات القطن ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من كلوريد الصوديوم من تحت الغطاء لتقليل المسافة بين زلة الغطاء وأوعية الأذن المستهدفة.
فئة
4. الفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية وتحريض الجلطة في الأذن اليمنى
- اضبط المجهر الفلوري داخل الحيوية لتصور FITC-dextran (450 - 490 نانومتر ؛ FT: 510 ؛ LP: 520). استخدم مصباح زئبقي متغير بقدرة 100 واط كمصدر للضوء. قم بتوصيل كاميرا CCD عالية الدقة بالأبيض والأسود بمسجل DVD.
- انقل على زجاج الأكريل الذي يحتوي على لوحة التسخين مع الأذن المختطفة الثابتة إلى مكتب المجهر الفلوري داخل الحيوية.
- باستخدام تكبير 20X (فتحة رقمية 20X/0.95) وشدة ضوء بنسبة 20٪، ابحث عن وعاء وريدي قطره 50-60 ميكرومتر وتدفق دم متقدمة يتراوح بين 400 - 600 ميكرومتر / ثانية.
- أضف قطرة واحدة من الماء بدرجة حرارة الغرفة إلى الغطاء للغمر في الماء بهدف التكبير 63x (فتحة رقمية 63X/0.95). استخدم حقنة بقنية قطرها 1 مم وضع القطرة على هدف المجهر. أضف كمية كافية من الماء للاتصال بالغطاء والهدف بقطرة الماء.
- مباشرة بعد تطبيق قطرة الماء ، ابدأ في تسجيل الوعاء لمدة 20 ثانية مع شدة ضوء 20٪ لقياس القطر وتدفق الدم في وضع عدم الاتصال.
- ابدأ تحريض الجلطة بعد 5 دقائق من حقن FITC-dextran. لهذا الغرض ، ارفع شدة الضوء إلى 100٪.
- أثناء تحريض الجلطة ، أغلق فتحة المجهر لمدة 2 ثانية خلال فترة 30 ثانية للتحقق من تدفق الدم. في حالة استمرار تدفق الدم ، افتح الفتحة مرة أخرى. في حالة توقف تدفق الدم ، راقب الوعاء لمدة 30 ثانية < / >
ملاحظه: يصنف الوعاء على أنه مسدود إذا ظل التدفق ثابتا لمدة 30 ثانية أو أكثر أو إذا كان الدم يتدفق إلى الوراء. إذا بدأ تدفق الدم مرة أخرى ، فافتح الفتحة تماما واستمر في تحريض الجلطة حتى يحدث انسداد الأوعية الدموية كما هو موضح أعلاه. أثناء تحريض الجلطة المبكر ، تأكد من أن الأوقات التي تم فيها إغلاق الفتحة للتحقق من تدفق الدم قصيرة قدر الإمكان من أجل الحفاظ على إضاءة epi-be مستمرة تقريبا. في وقت لاحق ، أثناء نمو الجلطة ، يتم حشو الوعاء بصبغة أقل فلورية ، لذلك يمكن ملاحظته باستمرار.
- حدد وسد 5 أوعية لكل أذن. الحد من وقت تحريض الجلطة تحت المجهر إلى حوالي 1 ساعة بعد حقن FITC-dextran.
