عزل الخلايا الوحيدة عن الدم الكامل عن طريق الانتقاء السلبي المناعي المغناطيسي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Plaisance-Bonstaff، K.، et al. العزلة ، التعدي ، وثقافة الخلايا الوحيدة البشرية الأولية. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا الوحيدة عن دم الإنسان الكامل عن طريق الفصل السلبي المناعي المغناطيسي. يمكن استخدام الخلايا الوحيدة المعزولة لمزيد من التحليل النهائي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

فئة

1. عزل الخلايا الوحيدة البشرية الأولية عن طريق الانتقاء السلبي المناعي المغناطيسي

1. اجمع 40 مل من الدم البشري الكامل الطازج (إما من مريض فيروس نقص المناعة البشرية ⁺ أو من مجموعة تحكم سليمة) في أربعة أنابيب مفرغة من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سعة 10 مل (10 مل من الدم لكل أنبوب). باستخدام تقنيات معقمة تحت خزانة السلامة الحيوية ، انقل كل 40 مل من الدم إلى أنبوب بروبيلين مخروطي سعة 50 مل.
2. باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة عزل الخلايا الأحادية البشرية المختارة (جدول المواد) ، أضف 2 مل من كوكتيل عزل الخلايا الأحادية ، الموجود في المجموعة ، إلى أنبوب الدم. الخرز المغناطيسي الدوامي ، المتوفرة أيضا في المجموعة ، لمدة 30 ثانية ، وإضافة 2 مل إلى أنبوب الدم.
   1. إذا كان أقل من 40 مل من الدم متاحا ، فقم بتقليل الكواشف المضافة. لخلط المحلول، قم بتسخين الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية بلاستيكية سعة 25 مل واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. افصل خليط الدم بالتساوي إلى أربعة أنابيب سعة 50 مل وأضف 30 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1 ملي مولار EDTA إلى كل أنبوب. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية بلاستيكية سعة 25 مل.
4. ضع الأنابيب في حاملات المغناطيس لمدة 10 دقائق لإزالة الخرز المغناطيسي المترافق بالأجسام المضادة. استخدم أربعة حاملات مغناطيسية في وقت واحد ، واحد لكل أنبوب ، للسماح بأوقات حضانة وعزل متسقة لكل عينة دم.
5. ارسم المحتويات من وسط كل أنبوب باستخدام ماصة بينما لا تزال في حاملات المغناطيس. احرص على عدم استخلاص خلايا الدم الحمراء (لا تزيد عن 10٪ من حجم البداية البالغ 10 مل) ، ووضع المحتويات في أحد الأنابيب الأربعة الجديدة سعة 50 مل.
6. أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الدوامي إلى كل أنبوب سعة 50 مل. ماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 25 مل واحتضانها عند RT لمدة 5 دقائق. ثم ضع الأنابيب في حاملات المغناطيس لمدة 5 دقائق.
7. انقل المحتويات بعناية من مركز كل أنبوب بينما لا تزال في حاملات المغناطيس إلى واحد من أربعة أنابيب جديدة سعة 50 مل. ضع كل أنبوب جديد سعة 50 مل مباشرة في حاملات المغناطيس لمدة 5 دقائق.
8. انقل المحتويات بعناية من مركز كل أنبوب إلى واحد من أربعة أنابيب جديدة سعة 50 مل. قم بتدوير جميع الأنابيب الجديدة سعة 50 مل بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق جميع الكريات الأربع في ما مجموعه 10 مل من PBS المعقم.
9. عد الخلايا عن طريق استبعاد التريبان الأزرق باستخدام مقياس كثافة الدم.
   ملاحظة: يتم الحصول على 8-20 × 10⁶ خلايا بشكل عام من 40 مل من الدم الكامل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.5 مليون EDTA إنفيتروجين AM9260G أنابيب جمع الدم البلاستيكية BD Vacutainer مع K₂EDTA BD Biosciences 366643 مغناطيس سهل 50 EasySep تقنيات الخلايا الجذعية 18002 طقم عزل الخلية الأحادية البشرية سهلة Sep مباشرة تقنيات الخلايا الجذعية 19669 برنامج تلفزيوني جيبكو 20012027 RPMI 1640 مع L-Glutamine كورنينج 10040سي في إم بي