تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
فئة
1. عزل الخلايا الوحيدة البشرية الأولية عن طريق الانتقاء السلبي المناعي المغناطيسي
- اجمع 40 مل من الدم البشري الكامل الطازج (إما من مريض فيروس نقص المناعة البشرية + أو من مجموعة تحكم سليمة) في أربعة أنابيب مفرغة من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سعة 10 مل (10 مل من الدم لكل أنبوب). باستخدام تقنيات معقمة تحت خزانة السلامة الحيوية ، انقل كل 40 مل من الدم إلى أنبوب بروبيلين مخروطي سعة 50 مل.
- باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة عزل الخلايا الأحادية البشرية المختارة (جدول المواد) ، أضف 2 مل من كوكتيل عزل الخلايا الأحادية ، الموجود في المجموعة ، إلى أنبوب الدم. الخرز المغناطيسي الدوامي ، المتوفرة أيضا في المجموعة ، لمدة 30 ثانية ، وإضافة 2 مل إلى أنبوب الدم.
- إذا كان أقل من 40 مل من الدم متاحا ، فقم بتقليل الكواشف المضافة. لخلط المحلول، قم بتسخين الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية بلاستيكية سعة 25 مل واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- افصل خليط الدم بالتساوي إلى أربعة أنابيب سعة 50 مل وأضف 30 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1 ملي مولار EDTA إلى كل أنبوب. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية بلاستيكية سعة 25 مل.
- ضع الأنابيب في حاملات المغناطيس لمدة 10 دقائق لإزالة الخرز المغناطيسي المترافق بالأجسام المضادة. استخدم أربعة حاملات مغناطيسية في وقت واحد ، واحد لكل أنبوب ، للسماح بأوقات حضانة وعزل متسقة لكل عينة دم.
- ارسم المحتويات من وسط كل أنبوب باستخدام ماصة بينما لا تزال في حاملات المغناطيس. احرص على عدم استخلاص خلايا الدم الحمراء (لا تزيد عن 10٪ من حجم البداية البالغ 10 مل) ، ووضع المحتويات في أحد الأنابيب الأربعة الجديدة سعة 50 مل.
- أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الدوامي إلى كل أنبوب سعة 50 مل. ماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 25 مل واحتضانها عند RT لمدة 5 دقائق. ثم ضع الأنابيب في حاملات المغناطيس لمدة 5 دقائق.
- انقل المحتويات بعناية من مركز كل أنبوب بينما لا تزال في حاملات المغناطيس إلى واحد من أربعة أنابيب جديدة سعة 50 مل. ضع كل أنبوب جديد سعة 50 مل مباشرة في حاملات المغناطيس لمدة 5 دقائق.
- انقل المحتويات بعناية من مركز كل أنبوب إلى واحد من أربعة أنابيب جديدة سعة 50 مل. قم بتدوير جميع الأنابيب الجديدة سعة 50 مل بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق جميع الكريات الأربع في ما مجموعه 10 مل من PBS المعقم.
- عد الخلايا عن طريق استبعاد التريبان الأزرق باستخدام مقياس كثافة الدم.
ملاحظة: يتم الحصول على 8-20 × 106 خلايا بشكل عام من 40 مل من الدم الكامل.
< p class = "jove_title" >
2. استزراع الخلايا الوحيدة البشرية الأولية
- باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية ، وسائط RPMI 1640 الدافئة الخالية من المصل مكملة بنسبة 1٪ بنسلين ستربتومايسين (قلم / بكتيريا) ، و (مع الاستمرار في استخدام التقنيات المعقمة تحت خزانة السلامة الحيوية) إعادة تعليق الخلايا الوحيدة المعزولة في هذه الوسائط بتركيز 1 × 106 خلايا / مل.
- أضف 1 مل من الخلايا المعلقة إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار أو في طبق 35 مم (يجب أن يكون العدد النهائي للخلايا 1 × 106 خلايا / لوحة) ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. انتظر لمدة 0.5-1.0 ساعة حتى تلتصق الخلايا.
- باستخدام حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، يتم استخدام مصل الأبقار الجنيني الدافئ المعطل بالحرارة (HI). أضف 100 ميكرولتر (تركيز نهائي 10٪) من FBS إلى كل طبق. أضف عوامل النمو إلى الخلايا لتعزيز تمايز البلاعم.
- البلاعم الأولية لنمط ظاهري يشبه M1 عن طريق إضافة 25 نانوغرام / مل من عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم (GM-CSF) إلى الوسائط. البلاعم الأولية لنمط ظاهري يشبه M2 عن طريق إضافة 50 نانوغرام / مل من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) إلى الوسائط.
ملاحظه: يسمح كل من GM-CSF و M-CSF بتمايز الخلايا الأحادية إلى نمط ظاهري عام للبلاعم (M0) أثناء تحضير الخلايا ل M1 أو M2 ، على التوالي.
