مقايسة تحلل الخلايا البدينة لدراسة تأثير مادة كيميائية مستهدفة

الملخص

المصدر: Tsvilovskyy, V., et al. عزل الخلايا البدينة المشتقة من الصفاق وتوصيفها الوظيفي باستخدام فحوصات التصوير وإزالة التحلل Ca²+.J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو مقايسة لونية لتحديد نشاط تحلل الخلايا البدينة. يقوم الإنزيم الذي تطلقه الخلايا البدينة بتحلل الركيزة وينتج منتجا ملونا. تم قياس نشاط تحلل الخلايا البدينة على أنه النسبة المئوية لإطلاق الإنزيمات خارج الخلية التي تم تطبيعها مع محتوى الإنزيم الكلي في الخلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل PMC وزراعته عن طريق الغسيل داخل الصفاق

1. عزل PMC عن طريق الغسيل داخل الصفاق
   1. قبل عزل الخلية ، قم بإعداد المواد المدرجة في الجدول 1.
   2. استخدم ذكور الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 14 أسبوعا لعزل PMC. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ ، وتأكيد الوفاة بفقدان ردود الفعل. رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول وثبته على كتلة رغوية باستخدام دبابيس (الجانب الظهري لأسفل). قم بإزالة الجلد البطني للفأر باستخدام مقص حاد. تجنب إتلاف التجويف البريتوني. < / > ملاحظه: نستخدم هذا البروتوكول عادة للفئران ذات الخلفية الجينية لسلالة C57BL / 6N.
   3. حقن 7 مل من وسط RPMI المثلج و 5 مل من الهواء في التجويف البريتوني باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة 27 جرام. ادفع الإبرة بعناية في الصفاق ولا تثقب أي أعضاء. استخدم بقعة في منطقة الدهون البربخية لتقليل خطر انثقاب الأعضاء.
   4. بعد الحقن ، هز الماوس لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا البريتونية في وسط RPMI. لا تهز الماوس بقوة لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية وتلويث التجويف البريتوني بالدم.
   5. أعد استخدام المحقنة سعة 10 مل عن طريق تجهيزها بقنية جديدة سعة 20 جراما. حرك الأعضاء الداخلية إلى جانب واحد عن طريق إمالة كتلة الرغوة والنقر عليها برفق على المقعد لتسهيل الشفط المتوسط من الجانب الآخر. أدخل إبرة 20 جم ، وشفط السائل من البطن برفق وببطء (~ 0.5 مل / ثانية) لتجنب انسداد الأعضاء الداخلية. اجمع أكبر قدر ممكن من السوائل (عادة 5-6 مل).
   6. قم بإزالة الإبرة من المحقنة وانقل تعليق الخلية المجمعة إلى أنبوب تجميع على الجليد. تخلص من أنبوب العينة إذا كان هناك تلوث دم مرئي.
   7. الطرد المركزي الأنابيب مع تعليق الخلية عند ~ 300 × جم لمدة 5 دقائق. تحت غطاء معقم شفط طاف. لكل فأر ، امزج عينة الكريات في 4 مل من البارد (4-10 درجات مئوية) PMC Medium وانقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة 25 سم². أضف عوامل النمو IL-3 و SCF إلى التركيزات النهائية البالغة 10 نانوغرام / مل و 30 نانوغرام / مل ، على التوالي. ضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) واحتضنها لمدة ~ 48 ساعة حتى الإجراء التالي.
2. ثقافة PMC
   1. اليوم 2 (~ 48 ساعة بعد العزل): تغيير متوسط
      1. لإزالة الخلايا الطافية وغير الملتصقة (كريات الدم الحمراء والخلايا الميتة)، استنشق الوسط من القارورة عن طريق وضع طرف ماصة باستور على حافة القارورة وإمساك القارورة أفقيا تقريبا. أضف 4 مل من PMC Medium المسخن مسبقا لكل ماوس. أضف عوامل النمو IL-3 (10 نانوغرام / مل) و SCF (30 نانوغرام / مل). ضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).
   2. اليوم 9: انقسام الخلايا
      1. انقل معلق الخلية من قارورة زراعة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 50 مل. اغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) ، وجمع تعليق الخلية مع الخلايا المنفصلة في نفس أنبوب الطرد المركزي البلاستيكي سعة 50 مل. احسب تركيز الخلية بواسطة مقياس كثافة الدم ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا.
      2. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند ~ 300 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية. استرجع الحبيبات في وسط PMC الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) للحصول على تركيز الخلية 1 × 10⁶ خلايا / مل. انقل معلق الخلية إلى قارورة ثقافة جديدة مقاس 25 سم². تخلص من القارورة القديمة مع الخلايا الليفية الملتصقة بالأسفل.
      3. أضف عوامل النمو IL-3 (10 نانوغرام / مل) و SCF (30 نانوغرام / مل) ، وضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
   3. الأيام 12-15: قياسات الخلية
      1. إذا تم التخطيط لأي تجارب مع تحفيز مستقبلات FcɛRI ، فقم بمعالجة الخلايا بين عشية وضحاها باستخدام 300 نانوغرام / مل من IgE المضاد ل DNP في وسط استزراع قياسي.

2. قياس إطلاق بيتا هيكسوسامينيداز في PMCs

1. قبل القياسات ، قم بإعداد المواد المدرجة في الجدول 2.
   ملاحظة: β-هيكسوسامينيداز الذي يتم إطلاقه من MCs بعد تحفيزها يحلل p-nitrophenyl-acetyl-D-glucosamine (pNAG) إلى p-nitrophenol و N-acetyl-D-glucosamine. تتناسب كمية β-hexosaminidase في العينة مع كمية p-nitrophenol التي سيتم تشكيلها. في بيئة عالية الأس الهيدروجيني ل "Stop Solution" ، يوجد p-nitrophenol على شكل p-nitrophenolat منزوع البروتون بالكامل ويمكن اكتشافه من خلال امتصاصه للضوء عند 405 نانومتر.
2. تحضير محلول Tyrode الذي يحتوي على 130 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي كلوريد كلوريد ، و 1.4 ملي كلوريد_{الملن 2} ، و 1 ملي ملي كلوريد₂ ، و 10 ملي هيبس ، و 5.6 ملي مولار جلوكوز ، و BSA 0.1٪. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع 3 M هيدروكسيد الصوديوم.
3. قم بإعداد محلول التحلل عن طريق إضافة حجم 1٪ من Triton X-100 إلى محلول Tyrode.
4. قم بإعداد محلول التوقف المكون من 200 ملي مولار جلايسين واضبط الرقم الهيدروجيني على 10.7 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
5. تحضير محلول pNAG (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) عن طريق إذابة pNAG في 0.4 M حامض الستريك إلى تركيز نهائي يبلغ 4 ملليمتر.
6. احسب كمية الخلايا اللازمة للفحص (قم بإجراء الفحص بشكل مكرر). استخدم 200,000 PMCs لكل بئر. استخدم 2 بئر كعناصر تحكم سلبية (محلول Tyrode بدون أي إفرازات مثل DNP أو المركب 48/80) و 2 بئر كعناصر تحكم إيجابية (محلول Tyrode مع 10 ميكرومتر Ionomycin) لكل نمط وراثي.
7. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 15 مل ، واضبط الحجم على 15 مل باستخدام محلول Tyrode ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور وأعد تعليق الخلايا في محلول Tyrode إلى 2 × 10⁶ خلايا / مل.
8. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر إلى لوح بئر 96 بئر على شكل حرف V. أضف 25 ميكرولتر من محلول التحفيز أو التحكم إلى كل بئر (وفقا لمخطط سحب العينات الموضح في الشكل 1 أ). احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
9. أوقف التفاعل عن طريق وضع الطبق المكون من 96 بئرا على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق عند 120 × جم. انقل 120 ميكرولتر من المادة الطافية باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى صفيحة مسطحة القاع سعة 96 بئرا وضعها على الثلج. تجنب بعناية لمس كريات الخلية ، ولكن استنشق المادة الطافية تماما.
10. أضف 125 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كريات الخلية. احتضان كريات الخلية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليقها بعد الحضانة عن طريق سحب العينات المتكرر (حوالي 5 مرات).
11. الماصة 25 ميكرولتر من محلول pNAG (4 ملليمتر) في الآبار المطلوبة لصفيحة جديدة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. أضف 25 ميكرولتر من كل مادة طافية إلى محلول pNAG المحضر بالإضافة إلى 25 ميكرولتر من كل محللة خلية.
12. احتضان دفعات التفاعل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتعبئة 150 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر لإيقاف التفاعل.
13. قم بتحليل اللوحة باستخدام قارئ لوحة دقيقة باستخدام إعداد الطول الموجي المزدوج عند 405 نانومتر مع المرجع 630 نانومتر لطرح الخلفية تلقائيا. في برنامج الاستحواذ ، حدد المربع "مرجع" وفي قائمة عنصر برنامج "الامتصاص" ، حدد "630 نانومتر" من القائمة المنسدلة. إذا كانت الكثافة البصرية للعينات عالية جدا ، فقم بإعداد تخفيف مناسب للمسبار قبل إعادة القياس.

الجدول 1: المواد الخاصة بالخطوة 1.

1 جليد 2 10 مل محاقن 3 27 جرام إبر 4 20 جرام إبر 5 كتلة ودبابيس الستايروفوم 6 أنابيب التجميع (50 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية) 7 70٪ إيثانول 8 RPMI متوسط (مبرد مسبقا ومحفوظ على الجليد) 9 PMC متوسط: RPMI متوسط + 20٪ FCS (مصل ربلة الساق الجنينية) + محلول ستربتومايسين بنسلين 1٪ (Pen-Strep) 10 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco - DPBS (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) 11 قوارير الثقافة (25 سم) 12 حلول مخزون عوامل النمو (IL-3: 1 ميكروغرام / ميكرولتر ؛ SCF: 2.5 ميكروغرام / مل) 13 الماصات المصلية (10 مل) 14 أطراف الماصات معقمة (20-200 ميكرولتر) 15 مقياس الدم 16 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء 17 مقص وملقط 18 غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ للفئران 19 غطاء محرك السيارة المعقم المفتوح 20 غطاء محرك السيارة المعقم المغلق 21 حاضنة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) 22 ماصات النقل (20-200 ميكرولتر)

الجدول 2: مواد الخطوة 2.

1 PMC (12-15 يوما) 1 × 10⁶ خلايا / مل 2 محلول مخزون الأجسام المضادة DNP (IgE) 3 حل مخزون DNP-HSA 4 مركب 48/80 حل مخزون 5 الأيونومايسين 6 96-لوحة بئر ، قاع على شكل حرف V 7 96-ألواح جيدة ، قاع مسطح 8 أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية (15 مل) 9 الماصات المصلية 10 حاضنة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) 11 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء 12 قارئ لوحة ميكروتيتر لقياسات الكثافة البصرية 13 ماصة متعددة القنوات (20-200 ميكرولتر) 14 مقياس الدم

النتائج

الشكل 1: يطلق بيتا هيكسوسامينيداز قياسات متعددة الآبار اللونية التي أجريت باستخدام PMCs المعزولة من الفئران البرية.(أ) مخطط تحفيز سحب العينات من 96 بئرا لإجراء اختبار بيتا هيكسوسامينيداز؛ يتم عرض النتائج في اللوحة B. يتوافق "Spontan" مع سحب ماصات محلول Tyrode دون إضافة أي إفرازات ؛ IM = الأيونوميسين. Cp 48/80 = المركب 48/80. (ب) رسم بياني شريطي يوضح ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI متوسط الترمو: العلمية 21875034 DPBS سيجما ألدريتش 14190144 FCS الترمو: العلمية R92157 IL-3 أنظمة البحث والتطوير 403 مل SCF الترمو: العلمية PMC2115 DNP-HSA سيجما ألدريتش أ 6661 الأجسام المضادة ل DNP سيجما ألدريتش د-8406 بنسترب الترمو: العلمية 15140122 كمبوند 48/80 سيجما ألدريتش سي 2313 4- (1،1،3،3-تتراميثيل بوتيل) فينيل بولي إيثيلين جلايكول سيجما ألدريتش X100 4-نيتروفينيل 2-أسيتاميدو-2-ديوكسي-β-د-جلوكوبيرانوزيد سيجما ألدريتش N9376 غرفة التصوير CoverWell سيجما ألدريتش GBL635051 96-لوحة بئر ، قاع على شكل حرف V كورنينج 3896 96-ألواح جيدة ، قاع مسطح غرينر بيو ون 655180 قارئ لوحة Microtiter مع برنامج "i-control" تيكان نانو كوانت، M200 Pro اللانهائي لوحة سفلية مسطحة غرينر بيو ون 655180 الأيونومايسين سيجما ألدريتش I9657 50 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سارستيدت 62.547.254 قوارير الثقافة (25 سم) غرينر بيو ون 69160 مقياس الدم VWR 631-0696 مصدر ضوء أحادي اللون أدوات سوتر لامدا DG-4 15 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سارستيدت 6,25,54,502 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء هيريوس ميجافوجي 1.0R