عزل وثقافة خلايا الفأر Kupffer

الملخص

المصدر: Bourgognon، M.، et al. Kupffer Cell Isolation لاختبار سمية الجسيمات النانوية. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل خلايا Kupffer أو ضامة الكبد عن كبد الفأر. يتم حشو الكبد بمحلول هضم متبوعا بفصل تدرج الكثافة. يمكن استخدام خلايا Kupffer الملتصقة المعزولة لمزيد من التحليل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التروية وجمع الخلايا (الشكل 1)

1. قم بإعداد جميع الكواشف الموضحة في جدول المواد طازجا.
2. قم بتسخين محلول EGTA (حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك) / HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك) (50 مل لكل فأر) ومحلول الكولاجيناز (100 مل لكل فأر) لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
3. اشطف الأنبوب المرن للمضخة أولا بنسبة 70٪ من الإيثانول. صب 40 مل من محلول EGTA / HBSS في أنبوب طرد مركزي مغمور في الحمام المائي واشطف الأنبوب المرن للمضخة بمحلول EGTA / HBSS الدافئ مسبقا.
4. إجراء التخدير النهائي باستخدام الباربيتيورات لإنتاج فقدان الوعي بشكل موثوق قبل الاكتئاب التنفسي والوفاة. حقن فينوباربيتون بمعدل 1 ملغم/كغ، في أنثى أو ذكر فأر CD1 (35-45 جم). تأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم.
5. حلق شعر البطن وتعقيم سطح البطن باستخدام محلول إيثانول بنسبة 70٪.
6. اقطع تجويف البطن وفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي عن طريق تحريك الأمعاء بشكل جانبي إلى يسار البطن.
7. ابدأ تشغيل المضخة بسرعة 1-3 مل / دقيقة باستخدام محلول EGTA / HBSS وقم بتدوير الوريد البابي باستخدام إبرة فراشة 23 جم (قطع الأجنحة). قم بتثبيت جزء الوريد البابي المقنن بإبرة 23 G ثم اقلب الملقط المنقي على سطح بطن الفأر المفتوح. يجب أن يتلاشى الكبد بسرعة خلال أول 30 ثانية من نضح محلول EGTA / HBSS.
8. شق الجزء السفلي من الوريد الأجوف السفلي بسرعة لتجنب تراكم الضغط الزائد في الكبد ، ثم قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة ، خلال الدقيقة الأولى من التروية. يموت بسبب نزيف ثانوي لبزل الوريد الأجوف.
9. عندما يتبقى أقل من 5 مل من محلول EGTA / HBSS في أنبوب الطرد المركزي ، املأه بمحلول الكولاجيناز (40-50 مل). قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى 10 مل / دقيقة ، على مدار 30 ثانية.
10. اجعل الكبد ينتفخ عن طريق الضغط على الوريد الأجوف السفلي ، باستخدام الملقط ، لمدة 5-10 ثوان. يمكن القيام بذلك بشكل دوري (5-10 مرات أثناء الهضم). ستعمل هذه الخطوة على تحسين تفكك خلايا الكبد وتقليل وقت التروية باستخدام الكولاجيناز.
11. عندما يبقى أقل من 10 مل من محلول الكولاجيناز داخل أنبوب الطرد المركزي ، اسكب 40-50 مل من محلول الكولاجيناز الدافئ مسبقا في أنبوب الطرد المركزي.
12. بعد 10-15 دقيقة من التروية وحوالي 70-80 مل من محلول الكولاجيناز المنقوع ، ضع ضغطا صغيرا على سطح الكبد باستخدام ملقط. تشير بصمة الضغط إلى أن خلايا الكبد منفصلة.
13. قم بإزالة الكبد من تجويف البطن في قطعة واحدة ووضعه في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 20-30 مل من وسط عزل خلايا كوبفر. احتفظ بخلايا الكبد على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 3 ساعات لتجنب التأثير على بقاء خلايا الكبد.
14. كرر إجراء التروية على العديد من إذا لزم الأمر ، مع الحفاظ على الكبد المنفخ على الجليد. تجمع من واحد إلى ثلاثة كبد للتنقية والمضي قدما في المرحلة 3.

< p class = "jove_title" >2. تحضير تدرج الكثافة للطرد المركزي (الشكل 2)

1. تابع الخطوات التالية (الأقسام 2 و 3 و 5) في ظل ظروف معقمة واحتفظ بالخلايا على الجليد أو عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد SIP (محلول جزيئات السيليكا المطلية متساوية التوتر) عن طريق خلط 15.3 مل من محلول جزيئات السيليكا المطلي مع 1.7 مل من 10 × PBS.
2. لعمل 20 مل من محلول SIP بنسبة 25٪ ، اخلطي 5 مل من SIP مع 15 مل من PBS. لعمل 20 مل من محلول SIP بنسبة 50٪ ، امزج 10 مل من SIP مع 10 مل من PBS.
3. املأ أنبوب طرد مركزي واحد ب 20 مل من محلول SIP بنسبة 50٪. قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي بزاوية قريبة من 90 درجة وأضف ببطء محلول SIP بنسبة 25٪ (20 مل) على الجدار الجانبي للأنبوب باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل ، دون لمس سطح طبقة SIP بنسبة 50٪. عند إضافة محلول SIP بنسبة 25٪ ، قم بتقليل زاوية الأنبوب تدريجيا. حافظ على تدرج الكثافة على الجليد حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >3. تنقية خلايا Kupffer (الشكل 3)

1. ضعي كبدا واحدا منفوخا في طبق بتري مع 15 مل من Kupffer Cell Isolation Medium. تمزق كبسولة جليسون (غشاء الكبد) باستخدام المقص وإطلاق جميع خلايا الكبد في وسط عزل خلية كوبفر. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ليتم جمعها في أنبوب طرد مركزي. كرر إجراء التروية على كبد إضافي منفوخ وتجمع الخلايا في نفس أنبوب الطرد المركزي (15 مل من فأر واحد ، وما يصل إلى 45 مل من ثلاثة فئران).
2. الطرد المركزي معلق الخلية عند 50 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، وستكون الخلايا المتني (خلايا الكبد) في الحبيبات وستكون الخلايا غير المتني (بما في ذلك خلايا Kupffer) في المادة الطافية.
3. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي نظيف وجهاز طرد مركزي بمعدل 50 × جم لمدة دقيقتين لكل منهما. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى.
4. جهاز طرد مركزي عند 1,350 × جم لمدة 15 دقيقة لبيليه الخلايا غير المتني. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من Kupffer Cell Isolation Medium.
5. أضف محلول الخلية غير المتني على التدرج متساوي التوتر المتقطع 25/50٪ كما هو موضح في 2.3. جهاز طرد مركزي عند 850 × جم لمدة 15 دقيقة دون تسارع أو كسر.
6. قم بتوطين جزء خلية Kupffer المخصب الذي يظهر عكرا داخل جزء SIP 25٪ بالقرب من واجهة SIP 25/50٪ (الشكل 3). باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، استنشق حوالي 12 مل من جزء خلية كوبفر المخصب. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 35-40 مل من وسط عزل الخلايا Kupffer. تخلط برفق وأجهزة الطرد المركزي عند 1,350 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لخلايا الحبيبات.
7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5-10 مل من وسط زراعة الخلايا Kupffer الدافئ مسبقا. عد الخلايا (مقياس كثافة الدم) وقياس قابلية البقاء باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
8. ضع الخلايا غير المتني النقية في ألواح 24 بئرا بكثافة 5 × 10⁵ خلايا / بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (الشكل 3). بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسط برفق ، واغسله بمحلول الملح المتوازن من Hank الدافئ مسبقا (HBSS) مرة واحدة ثم استبدله ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا Kupffer الطازج والدافئ مسبقا (لكل بئر).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تروية الكبد. بعد تخدير الفأر ، يتم نقل الجهاز الهضمي بشكل جانبي إلى يسار البطن من أجل تسهيل الوصول إلى الوريد البابي (PV). يتم تعبيث الوريد الأجوف باستخدام معدل تدفق بطيء (1-3 مل / دقيقة) من محلول EGTA / HBSS ويتم تمزق الوريد الأجوف السفلي (IVC) على الفور لتجنب أي ضغط زائد داخل الكبد. خلال الدقيقة الأولى من التروية ، يزداد معدل التدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة. ثم يتم حشو محلول الك...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Euthatal (الصوديوم البنتوباربيتال) ميريال الفئران CD1 نهر تشارلز - يجب أن يتراوح وزن الفأر من 35 إلى 45 جم. ننصح باستخدام ذكور الفئران CD1 حيث يزداد وزنها بسرعة (على سبيل المثال ، يتجاوز وزن فأر CD1 الذكر البالغ من العمر 7 أسابيع 35 جراما). ينصح أيضا بالاتصال بمورد مسبقا لترتيب تسليم الأكبر سنا. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون في المنزل للوصول إلى الوزن المطلوب. HBSS (خال من Ca²⁺ و Mg²⁺ ، مع البيكربونات) تقنيات الحياة هاتف: 14175-053 يجب أن يكون HBSS خاليا^{من Ca 2+}. ملح رباعي الصوديوم حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA) سيجما ألدريتش E8145 يمكن أيضا استخدام EDTA ولكن EGTA لديها ميزة مخلب Ca²⁺ بشكل انتقائي. هيبس (1 م) تقنيات الحياة هاتف: 15630-056 100 مل الكولاجيناز النوع الرابع ورثينجتون سي إس إل-4 ينصح باختبار دفعات مختلفة من الكولاجيناز أو على الأقل ذكر للمورد أن المنتج يجب أن يكون مناسبا لعزل خلايا الكبد انخفاض الجلوكوز DMEM سيجما ألدريتش د5523 500 مل RPMI (مع بيروفات الصوديوم والجلوتاماكس®) تقنيات الحياة هاتف: 12633-012 500 مل البنسلين / ستيبتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 100 مل مصل الأبقار الجنينية الرابط الأول 60-00-850 500 مل محلول تريبان الأزرق سيجما ألدريتش تي 8154 100 مل محلول جزيئات السيليكا المطلي (بيركول®) جنرال إلكتريك هيلتكير 17-0891-02 Percoll® مستقر للغاية ويمكن الاحتفاظ به لعدة سنوات 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات تقنيات الحياة 10010-023 500 مل 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات تقنيات الحياة 70011-036 500 مل مجموعة جمع دم الفراشة (أنابيب بطول 23 جم / 305 مم) دينار بحريني 367288 مرشحات الحقن (0.22 ميكرومتر حافة زرقاء) مينيسارت 16534-ك أنابيب الطرد المركزي (50 مل غطاء أزرق) BD Biosciences ، فالكون 35 2070 طبق بتري (90 × 15 مم) ثيرمو فيشر العلمي بي إس إن 101 في آر 20 مصفاة خلية 100 ميكرومتر دينار بحريني هاتف: 352360 مضخة تمعجية واتسون مارلو سكيو 300 اشطف الأنبوب قبل وبعد كل استخدام باستخدام PBS معقم و 70٪ إيثانول. أطباق 24 بئر كورنينج 3526 الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص ملقط Serrefine Hammacher GmbH المادة رقم HSE 004-35 / Cat. رقم 221-0051 تسمح الملقطات المتنقية بتثبيت الوعاء المقنن بإبرة 23G دون الحاجة إلى إمساك الملقط أثناء إجراء التروية. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) مكشطة الخلية BD Biosciences ، فالكون 353086 قم بقص أطراف الشفرة بمقص لكشط الخلايا في ألواح 24 بئرا. EGTA (حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك) / HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك) يحتوي HBSS على 0.5 ملي EGTA و 25 ملي HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تحضير 50 مل لكل كبد لنفخ. محلول الكولاجيناز DMEM منخفض الجلوكوز يحتوي على الكولاجيناز من النوع الرابع عند 100 UI / مل و 15 ملي مولار HEPES و 1٪ بنكلين / ستربتامايسين (v / v). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تحضير 100 مل لكل كبد لنفخ. بعد إضافة الكولاجيناز ، ينصح بتسخين المحلول لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. هذا يسمح لنشاط الكولاجيناز بأن يكون على النحو الأمثل. وسط عزل الخلايا Kupffer يحتوي RPMI على 1٪ أحماض أمينو غير أساسية (v / v) و 1٪ جلوتاماكس® (v / v) و 1٪ بنيكلين / ستربتومايسين (v / v). تحضير 100 مل على الأقل ل 1-3 كبد. وسط زراعة الخلايا Kupffer يحتوي RPMI على 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ أحماض أمينو غير أساسية (v / v) ، 1٪ جلوتاماكس® (v / v) و 1٪ بنكلين / ستربتامايسين (v / v). تحضير 100 مل على الأقل ل 1-3 كبد. SIP (محلول جزيئات السيليكا المطلية متساوية التوتر) امزج 1.7 مل من محلول ملحي مخزن بمقدار 10x من الفوسفات مع 15.3 مل من Percoll® للحصول على 17 مل من SIP. حل SIP 25٪ امزج 5 مل من SIP مع 15 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات حل SIP 50٪ امزج 10 مل من SIP مع 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات عازلة التحلل وسائط DMEM مع 0.9٪ Triton X-100 حل PBS / BSA تحضير محلول ملحي طازج مخزن بالفوسفات 7.4 مع 1٪ ألبومين مصل البقري.