تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى ضامة

الملخص

المصدر: Lopez-Yrigoyen, M., et al. إنتاج وتوصيف البلاعم البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. J. Vis. Exp. (2020).

< ص الفئة = "jove_content">يصف هذا الفيديو طريقة في المختبر لتوليد البلاعم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs). يحدث توليد البلاعم من iPSCs على ثلاث مراحل: (أنا) تجميع iPSCs في تعليق لتشكيل أجسام جنينية ثلاثية الأبعاد (EBs) التي تتمايز إلى خلايا الأديم المتوسط, (ثانيا) تشكيل خلايا سلائف البلاعم من EBs المتمايزة, و (ثالثا) تمايز الخلايا السليفة الضامة إلى ناضجة, الضامة الوظيفية.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. تمايز iPSC البشري إلى البلاعم

ملاحظة: تم تصوير ملخص تخطيطي لبروتوكول تمايز البلاعم في الشكل 1.

1. تحضير عوامل النمو وتمايز الخلايا والكواشف الأخرى
   1. تحضير وسائط خالية من مصل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC-SFM; انظر جدول المواد) عن طريق استكمال النسر المعدل F12 (DMEM / F12) من Dulbecco مع مكمل hESC ، و 1.8٪ وزن / v ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 0.1 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول.
   2. تحضير محلول 0.1٪ وزن / حجم من الجيلاتين الخنازير عن طريق إذابة الجيلاتين في ماء معقم. يمكن تخزين محلول الجيلاتين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات.
   3. تحضير محلول مخزون البروتين المورفوجيني للعظام البشرية (BMP4) (25 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة BMP4 إلى محلول 4 ملي مولار من كلوريد الهيدروجين (HCl) -0.2٪ BSA PBS. قم بتوزيع محلول المخزون على شكل 50 ميكرولتر في أنابيب التبريد. يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين مخزون BMP4 عند 4 درجات مئوية لمدة 5 أيام.
   4. قم بإعداد محلول مخزون عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية (VEGF) (100 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة VEGF في محلول BSA PBS بنسبة 0.2٪. قم بتوزيع محلول المخزون على شكل 10 ميكرولتر في أنابيب التبريد. يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين مخزون VEGF عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام.
   5. تحضير محلول مخزون عامل الخلايا الجذعية البشرية (SCF) (100 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة SCF في محلول BSA PBS بنسبة 0.2٪. توزيع محلول المخزون على شكل 5 ميكرولتر في أنابيب التبريد. يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين SCF في 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام.
   6. قم بإعداد محلول مخزون إنترلوكين -3 (IL3) البشري (10 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة IL3 في محلول BSA PBS بنسبة 0.2٪. قم بتوزيع محلول المخزون على شكل 500 ميكرولتر في الأنابيب التبريدية. يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين مخزون IL3 عند 4 درجات مئوية لمدة 15 يوما.
   7. قم بإعداد محلول مخزون عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشري (CSF1) (10 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة CSF1 في محلول BSA PBS بنسبة 0.2٪. وزع محلول المخزون على شكل 1 مل من الحصص في أنابيب التبريد. يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين مخزون CSF1 عند 4 درجات مئوية لمدة 15 يوما.
2. المرحلة 1: توليد الأجسام الجنينية (اليوم 0 - اليوم 3)
   1. في اليوم 0 ، أضف 2.25 مل من وسائط المرحلة 1 (hESC-SFM مكمل ب 50 نانوغرام / مل BMP4 ، و 50 نانوغرام / مل VEGF ، و 20 نانوغرام / مل SCF) في بئرين من ألواح 6 آبار مرفقة للغاية.
   2. استبدل وسائط الصيانة لواحد 80٪ بئر ملتقى من iPSCs في لوحة 6 آبار مع 1.5 مل من المرحلة 1 الوسائط.
   3. قم بقص المستعمرات باستخدام أداة تمرير الخلية ونقل المستعمرات المقطوعة بماصة إلى بئرين من لوحة 6 آبار مرفقة منخفضة للغاية (انظر جدول المواد).
   4. في اليوم 2 ، أحضر السيتوكينات إلى تركيز نهائي يبلغ 50 نانوغرام / مل BMP4 و 50 نانوغرام / مل VEGF و 20 نانوغرام / مل SCF باستخدام 0.5 مل من وسائط hESC-SFM.
      ملاحظه: ستصبح مستعمرات IPSC EBs (الشكل 2 أ).
3. المرحلة 2: ظهور الخلايا المكونة للدم في معلق
   1. في اليوم 4 ، قم بتغطية 4 آبار من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار مع 0.1٪ وزن / حجم الجيلاتين واحتضانها لمدة 10 دقائق على الأقل.
   2. قم بإزالة الجيلاتين وإضافة 2.5 مل من وسائط المرحلة 2 (X-VIVO15 مكمل ب 100 نانوغرام / مل CSF1 ، 25 نانوغرام / مل IL-3 ، 2 ملي جلوتاماكس ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، و 0.055 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول).
   3. اجمع EBs المشكلة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واسمح لها بالاستقرار في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية. استنشق الوسائط بعناية.
   4. قم بتعليق EBs في 2 مل من وسائط المرحلة 2.
   5. نقل 10-15 EBs (لا يزيد عن 15) إلى بئر مطلي بالجيلاتين يحتوي على 2.5 مل من وسائط المرحلة 2.
   6. احتضان EBs عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ الهواء.
   7. قم بتغيير الوسائط على EBs المطلية كل 3-4 أيام لمدة 2-3 أسابيع.
   8. بعد 2-3 أسابيع ، تبدأ EBs في إطلاق خلايا مكونة للدم غير الملتصقة في المعلق.
      ملاحظه: يمكن أن تختلف هذه الفترة من إطلاق الخلايا المعلقة وتعتمد على خط الخلية. يمكن حصاد الخلايا الموجودة في هذا المعلق ونضجها إلى ضامة (انظر المرحلة 3) (الشكل 2 أ).
4. المرحلة 3: نضوج البلاعم الطرفية
   1. اجمع الخلايا المعلقة المكونة للدم وتجديد الوسائط (وسائط المرحلة 2) على لوحة EB.
   2. خلايا تعليق أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق.
   3. أعد تعليق الخلايا المعلقة في وسائط المرحلة 3 (X-VIVO15 مكمل ب 100 نانوغرام / مل CSF1 ، 2 ملي مولار جلوتاماكس ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين).
   4. تم جمع الألواح ونسجها على ألواح بلاستيكية غير معالجة مقاس 10 سم (10 مل) أو ألواح زراعة الأنسجة غير المطلية المكونة من 6 آبار (3 مل) بكثافة 0.2 × 10⁶ خلايا / مل.
   5. احتفظ بالخلايا في وسائط المرحلة 3 لمدة 9-11 يوما ، وقم بتغيير الوسائط كل 5 أيام.
      ملاحظه: يمكن تكرار الخطوات 1.4.1-1.4.5 من المرحلة 3 كل 3-4 أيام ويمكن حصاد خلايا التعليق من لوحة EB الأصلية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

النتائج

الشكل 1: ملخص رسومي للتمايز iPSC إلى الضامة الوظيفية الناضجة. رسم تخطيطي مرسوم باستخدام Biorender.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: تمايز iPSC نحو البلاعم ورقم iPSC-DM والتشكل. (أ) صور المجال الساطع التي تم الحصول عليها من (من اليسار إلى اليمين): ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميق ثيرموفيشر ج 10046 وسائط الحفظ بالتبريد نادد CS10 سيغما سي 2874 CTS CELLstart الركيزة إنفيتروجين A1014201 ركيزة الخلايا الجذعية جيلاتين جلد الخنازير سيغما جي 9136 بروتين BMP4 البشري المؤتلف البحث والتطوير 314-BP-010 المؤتلف البشري IL3 بريبروتك 0200-03-10 MCSF البشري المؤتلف (خال من الناقل) 100 ميكروغرام بيوليجند 574806 بروتين VEGF البشري المؤتلف البحث والتطوير 293-VE-010 SCF (C-Kit Ligand) بروتين بشري مؤتلف ثيرموفيشر PHC2111 StemPro hESC SFM ثيرموفيشر A1000701 StemPro EZPassage أداة مرور الخلايا الجذعية القابل للتصرف ثيرموفيشر 23181010 لوحات التثبيت المنخفضة للغاية: لوحة متعددة الآبار لزراعة الخلايا ، 6 آبار ، سطح طارد للخلايا النجمية للخلية غرينر 657970 2-ميركابتو إيثانول (50 ملم) إنفيتروجين 31350010 DPBS ، كالسيوم ، مغنيسيوم (500 مل) ثيرموفيشر 14040091 مكمل GlutaMAX ثيرموفيشر 35050061