تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. جمع DRG القطني من الفئران التجريبية
- قبل البدء في التجربة ، قم بإعداد محلول العمل لوسط تدرج الكثافة (على سبيل المثال ، Percoll) عن طريق خلط 9 أحجام من الوسط مع حجم واحد من Ca ++ / Mg ++ - خال من 10x HBSS. احتفظ بها على الجليد.
- قم بتخدير الماوس باستخدام 2.5٪ Avertin. تأكد من أن مخدر تماما بسبب عدم الاستجابة لقرصة المخلب الخلفي.
ملاحظة: تم استخدام كل من الفئران من الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.
- قم ببث الماوس عبر القلب مع 10 مل من 1x PBS المبرد مسبقا.
- ضع الماوس في وضع ضعيف بأربعة أقدام مثبتة بالشريط داخل غطاء دخان كيميائي. ارفع الجلد أسفل القفص الصدري بواسطة الملقط ، وقم بعمل شق صغير بمقص جراحي لكشف الكبد والحجاب الحاجز.
- استمر في استخدام المقص لقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري ، وفتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض.
- قم بقص الزائدة الأذينية اليمنى بسرعة باستخدام مقص القزحية. بمجرد ملاحظة النزيف ، أدخل إبرة 30 جم في الطرف الخلفي للبطين الأيسر ، وقم بحقن 10 مل ببطء من 1x PBS المبرد مسبقا لنشر.
- قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية على الفأر الموضوع في وضع الانبطاح.
ملاحظه: إذا تم التخطيط لزراعة الخلايا ، قم برش الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الشق واستخدم أدوات جراحية معقمة مسبقا للتشريح.
- استخدم مشرطا بحجم 11 لعمل شق عميق جانبي طولي يبدأ من المنطقة الصدرية وصولا إلى المنطقة العجزية. قم بإزالة الجلد بالمقص لكشف طبقة العضلات الظهرية.
- استخدم Friedman-Pearson Rongeur لتقشير الأنسجة والعضلات الضامة حتى تتعرض عمليات العمود الفقري القطني العجزي والعمليات المستعرضة الثنائية.
- استخدم مقص نويز الربيعي لفتح العمود الفقري الظهري بعناية ، ثم قم بالتبديل إلى Friedman-Pearson Rongeur لإزالة عظام العمود الفقري لكشف الحبل الشوكي مع توصيل الأعصاب الشوكية السليمة.
- قم بتشريح DRG القطني المماثل والمقابل بعناية (L4 / L5 DRG في دراستنا) وضعه في 1 مل من Ca ++ / Mg ++ - المثلج البارد 1x HBSS في مخالط الأنسجة Dounce. الآن الأنسجة جاهزة للخطوة 2.
ملاحظه: قم بقص العصب الشوكي المتصل ب DRG إن أمكن.
2. عزل الخلايا المفردة عن DRG القطني للماوس
قم - بتجانس أنسجة DRG بمدقة فضفاضة في الخالط Dounce 20-25 مرة.
- ضع مصفاة خلية نايلون معقمة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. بلل مصفاة الخلية ب 800 ميكرولتر من 1x HBSS المثلج ، ويتم جمع التدفق في الأنبوب المخروطي.
- اجمع معلق الأنسجة المتجانسة من الخالط باستخدام ماصة وقم بالمرور عبر مصفاة خلايا النايلون الرطبة 70 ميكرومتر إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
- اشطف الخالط مرتين ب 800 ميكرولتر من 1x HBSS المثلج ثم صبه في نفس الأنبوب المخروطي سعة 50 مل باستخدام مصفاة خلية لزيادة المحصول.
- أضف 1.5 مل من وسط التدرج متساوي التوتر ذو الكثافة المتساوية للثلج البارد (المحضر في الخطوة 1.1) في أنبوب FACS معقم من البوليسترين سعة 5 مل.
- انقل الخلية المتجانسة من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل (في الخطوة 2.4) إلى أنبوب FACS ، واخلطه جيدا مع وسط تدرج الكثافة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. أضف 500 ميكرولتر إضافي من 1x HBSS لإغلاق الجزء العلوي.
- حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
قم - بشفط المادة الطافية التي تحتوي على المايلين بعناية في الوسط دون إزعاج حبيبات الخلية في الجزء السفلي من أنبوب FACS.
- أعد تعليق الخلايا في PBS أو FACS المخزن المؤقت الذي يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) لتحليل FACS.
ملاحظه: من المتوقع أن يكون ما لا يقل عن 50,000 إلى 100,000 خلية من L4 / L5 DRG لماوس واحد.
- أعد تعليق خلايا DRG المعزولة ميكانيكيا (L4 / L5) في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني ثم احتضانها بجسم مضاد CX3CR1-APC α فأر (1: 2,000) في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
- اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS مرة واحدة ؛ طرد الخلايا 360 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- استنشق المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من PBS لتحليل FCAS. إذا تم التخطيط لفرز الخلايا، فقم بإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS بدلا من ذلك.