تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. خطوات الاستئصال الجراحي وإعداد الأنسجة:
- الاستئصال الجراحي للأمعاء الدقيقة (SI)
- القتل الرحيم للفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 الاختناق أو أي طريقة معادلة معتمدة من قبل لجنة أخلاقيات المؤسسية.
- انقل الماوس إلى منطقة مخصصة للاستئصال الجراحي. ضع المؤخرة لأسفل وقم بتعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. إجراء شق البطن عن طريق قطع جلد البطن والصفاق على طول خط الوسط من العانة إلى القفص الصدري وبالتالي فتح التجويف البريتوني.
ملاحظه: قم بإجراء الشق الأول على مساحة صغيرة نسبيا من الجلد لتجنب اختراق التجويف البريتوني وإتلاف أنسجة الأمعاء. استمر في الاستئصال حتى الحد التشريحي المطلوب.
- تحديد الغدد ، وهو معلم مثالي للكشف عن الدقاق النهائي ، والذي يشكل الجزء البعيد من الأمعاء الدقيقة.
ملاحظه: عادة ما يقع الرأس في الجانب الأيسر السفلي من بطن الفأر.
حدد - الوصلة اللفائفية وقم بعمل قطع في هذا المستوى بعيدا قدر الإمكان لفصل الأمعاء الدقيقة عن الستر. خلال الخطوات التالية ، تجنب الاتصال الجسدي المفرط بجدار الأمعاء لأن PPs الهشة تنهار بسهولة عند لمسها.
- قم بإزالة الأمعاء الدقيقة بأكملها برفق حتى العضلة العاصرة البوابية عن طريق قطع المساريق باستخدام المقص. حدد التقاطع بين البواب والاثني عشر ، وقص الاثني عشر عند هذا المستوى ، مما سيؤدي إلى انفصال كامل للأمعاء الدقيقة عن تجويف البطن.
ملاحظة: (ط) تجنب فرط التمدد لأن ذلك قد يتسبب في تمزق جدار الأمعاء. (ثانيا) إذا كان عزل الخلايا الليمفاوية LP مطلوبا بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية PP ، فمن الضروري الإزالة الكاملة للدهون المساريقية. ومع ذلك ، بالنسبة لعزل PP فقط ، يمكن أن توفر الدهون المساريقية المتبقية بعض الفوائد أثناء خطوات العزل الإضافية. لذلك ، يجب الحفاظ عليها.
- ضع الأمعاء الدقيقة المنفصلة في صفيحة مكونة من 6 آبار مملوءة بمصل بقري الجنين البارد + 10٪ (FBS) وحرك الأنسجة يدويا برفق حتى تغمر جميع أجزاء الأمعاء في الوسط البارد. حافظ على الأنسجة على الجليد خلال الخطوات التالية.
- بعد تشريح العدد المطلوب من الأمعاء الدقيقة للفأر ، انتقل إلى استئصال PP من الأمعاء الدقيقة التي تم جمعها.
- الاستئصال الجراحي ل PPs وتحضير تعليق الخلية الواحدة:
- انقل الأمعاء الدقيقة برفق على منشفة ورقية عن طريق الإمساك بالدهون المساريقية باستخدام الملقط ووضع الجانب المساريقي المواجه للمنشفة الورقية. بلل الجزء المعوي بالكامل باستخدام RPMI البارد + FBS 10٪ لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق.
ملاحظه: يمكن أن تكون الدهون المساريقية المتبقية مفيدة في هذه المرحلة لأن أجزاء الأنسجة الدهنية على الجانب المساريقي من SI ستلتصق بالمناشفة الورقية مع الحفاظ على الجانب المضاد للمساريقي متجها لأعلى.
- حدد PPs ، التي تظهر على شكل مجاميع بيضاء متعددة الفصيصات في شكل "يشبه القرنبيط" على الجانب المضاد للمساريقي من جدار الأمعاء.
ملاحظه: لا ينصح بطرد المحتوى اللمعي حتى يتم استئصال جميع PPs. قد يتسبب إفراغ المحتوى اللمعي في انهيار PPs وسيمنع تباين الألوان بين PPs وجدار الأمعاء ، وهو أمر مفيد جدا للتعرف البصري على PPs.
- بعد تحديد PPs على الجانب المعوي ، ضع المقص الجراحي المنحني على PPs (يجب أن يكون المنحنى متجها لأعلى) مع تقييد PP من حدوده البعيدة والقريبة.
اختياري: ادفع PP برفق باتجاه شفرات المقص باستخدام طرف الإصبع. ستؤدي هذه المناورة إلى استبعاد أفضل للأنسجة المحيطة غير PP. استئصال PPs برفق ، باستثناء أنسجة الأمعاء المحيطة.
ملاحظة: (ط) هذه الخطوة ضرورية للحصول على أقصى إنتاجية لخلايا PP مع تقليل تلوث الخلايا من الأجزاء المعوية المجاورة مثل LP والظهارة المعوية ، والتي هي أيضا غنية بالخلايا التائية. (ii) من واحد SI مقطوع من ماوس C57BL / 6 ، يمكن جمع 5-10 PPs (متوسط الحجم ، متعدد الفصيصات). من خلال استهداف PPs أصغر (غير متعددة الفصيصات) ، يمكن جمع ما يصل إلى 12-13 PPs لكل ماوس (C57BL / 6) باستخدام هذا البروتوكول.
- انقل PPs المقطوعة إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا مملوءة ب RPMI المثلج + 10٪ FBS والحفاظ عليها على الجليد باستخدام ملقط أو مقص جراحي منحني.
ملاحظة: (ط) مباشرة بعد استئصال PPs ، يمكن تنظيف المخاط ومحتوى الأمعاء على سطح PP عن طريق فرك المنديل برفق على منشفة ورقية. ستساعد هذه الخطوة في تحسين صلاحية الخلايا الليمفاوية PP. (ثانيا) بدلا من نقل PPs إلى لوحة ، يمكن أيضا النظر في النقل إلى أنابيب منفصلة اعتمادا على العدد الإجمالي للعينة.
- اختياري: عند اكتمال استئصال PP ووضعه لاحقا في لوحة البئر ، يمكن توثيق عدد وحجم PPs التي تم جمعها من مجموعات تجريبية / فأرية مختلفة عن طريق التقاط صورة للوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على PPs.
- قم بإعداد مجموعة من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل مملوءة ب 25 مل من RPMI + 10٪ FBS (دافئة مسبقا عند 37 درجة مئوية). باستخدام زوج من المقص ، قم بقص حافة طرف 1,000 ميكرولتر من المسافة التي ستسمح بشفط PPs بماصة 1 مل. قم بشفط PPs بماصة سعة 1 مل وانقلها من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا إلى الأنابيب المخروطية المحضرة سعة 50 مل.
ملاحظه: استخدم طرفا جديدا لكل عينة من عينات الفأر لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
- قم بتأمين الغطاء وضع الأنابيب عموديا في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، مع تحريك مستمر عند 125-150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء ، قم بإعداد مجموعة جديدة من أنابيب سعة 50 مل وضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر أعلى كل أنبوب ، والتي من خلالها سيتم تحضير تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: (ط) ستؤدي خطوة التحريض إلى إزالة المحتوى المعوي المتبقي والمخاط وحطام الخلايا ، مما يقلل من صلاحية الخلية واستعادة الخلايا الليمفاوية البولي بروبيلين إذا لم تتم إزالتها. (ثانيا) لا تضع أي نوع من الإنزيمات الهاضمة على أنسجة PP لأن عملية الهضم تسبب فقدانا كبيرا لتعبير CXCR5 من سطح الخلية.
- بعد التحريض ، انقل PPs إلى مصفاة الخلية 40 ميكرومتر الموضوعة في الجزء العلوي من الأنابيب المخروطية المعدة حديثا سعة 50 مل. باستخدام الجانب المستدير لمكبس حقنة سعة 10 مل ، قم بتعطيل PPs برفق من خلال مصفاة الخلية لتوليد تعليق أحادي الخلية. اشطف المصفاة ب 15-20 مل من RPMI البارد + 10٪ FBS.
ملاحظة: (i) قبل التصفية ، قم بهز الأنابيب التي تحتوي على PPs أفقيا. سيسهل هذا الاهتزاز القصير نقل PPs إلى مصافي الخلايا. (ii) يوصى باستخدام مصفاة خلوية 70 ميكرومتر لعزل الخلايا المناعية غير اللمفاوية (على سبيل المثال ، الخلايا الوحيدة ، الضامة ، DCs).
- جهاز الطرد المركزي المعلقات أحادية الخلية عند 350-400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
تخلص - من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا بتركيز 10 × 106 خلايا / مل. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.