عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة عن المعاطف الروائية البشرية

الملخص

المصدر: Mily، A.، et al. استقطاب الخلايا البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة M1 و M2 والتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي على عدوى المتفطرة السلية. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، PBMCs ، التي تحتوي على خلايا وحيدة وخلايا ليمفاوية من طبقة مصفرة بشرية عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يمكن استخدام PBMCs المعزولة لمزيد من التحليل.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الوسائط

ملاحظة: يتم توفير تفاصيل حول جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية في جدول المواد.

1. RPMI الوسيط الكامل: مكمل RPMI 1640 مع 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 2 ملي مولار ل-جلوتامين ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 10٪ مصل بقري جنين معطل بالحرارة (FBS). تجنب المضادات الحيوية في وسط زراعة الخلايا عند العمل مع عدوى Mtb.
2. وسيط RPMI خال من المصل: مكمل RPMI 1640 مع 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 2 ملي مولار ل-جلوتامين ، و 10 ملي مولار HEPES.

فئة

2. عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي من المعاطف المصنوعة

ملاحظة: قم بأداء جميع الأعمال بدم الإنسان (يحتمل أن يكون معديا) داخل خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية. قم بتعطيل منتجات الدم المتبقية بالمطهرات لمدة 15 دقيقة قبل التخلص منها. تم الحصول على الدم من متطوعين أصحاء في هذه الحالة. تم إعداد بروتوكول تمايز البلاعم في المختبر ليشمل 10 × 10⁶ PBMCs معزولة / مانح / بئر. من كل متبرع ، تحتوي طبقة واحدة من الكريات البيض على حوالي 50 مل من معلق الكريات البيض المركز الذي ينشأ من الدم الكامل ، والذي يوفر عادة 500-800 × 10⁶ PBMCs والتي يمكن من خلالها استرداد ما يقرب من 10٪ أو 50-80 × 10⁶ خلايا وحيدية.

1. قم بتحميل 15 مل من الدم المغطى فوق 15 مل من وسط تدرج الكثافة المحضر في أنبوب 50 مل. قم بتراكب الدم ببطء فوق طبقة تدرج الكثافة عن طريق إمالة طرف الماصة إلى جدار الأنبوب.
2. قم بتدوير الأنابيب عند 600 × جم لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع 0 تسارع و 0 تباطؤ.
   ملاحظه: أغلق الأغطية بعناية قبل الطرد المركزي وتحقق دائما من حوامل الأنبوب بحثا عن الامتداد المحتمل بعد الطرد المركزي.
3. قم بإزالة طبقة البلازما العلوية باستخدام ماصة باستور معقمة، وبعد ذلك اجمع طبقة الخلية أحادية النواة بعناية في أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة باستور معقمة. أضف وسيط RPMI الخالي من المصل إلى حبيبات PBMC للحصول على حجم نهائي قدره 50 مل. امزج بعناية عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات قبل الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
4. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق قلب الجزء السفلي من الأنبوب داخل الأصابع.
5. لإزالة تلوث وسط تدرج الكثافة من PBMCs ، اغسل الخلايا 2-3 مرات باستخدام RPMI الخالي من المصل للحصول على حجم نهائي يبلغ 50 مل. جهاز طرد مركزي بوزن 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. اغسل حتى يصبح المادة الطافية للخلية شفافة.
6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 20 مل من وسط RPMI الخالي من المصل.
7. عد الخلايا عن طريق تلطيخ الأزرق ، أو يدويا باستخدام مقياس كثافة الدم ، أو باستخدام عداد الخلايا الآلي. قم بتخفيف تعليق الخلية باللون الأزرق في تخفيف 1: 2 أو 1:10 عن طريق خلط العينة الزرقاء للخلية في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، على سبيل المثال ، 50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر (لعد مقياس الدم) أو 10 ميكرولتر + 10 ميكرولتر (لعد الخلايا الآلي) وعد الخلايا للحصول على عدد الخلايا الحية / مل
   أنذر: التريبان الأزرق سام ويجب التخلص منه في نفايات كيميائية منفصلة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ليمفاوريب Alere Technologies AS 11508545 RPMI 1640 شركة لايف تكنولوجيز SH30096.01 EDTA (0.5 م) مستشفى جامعة كارولينسكا ، هودينج غير متاح Na-pyruvate جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة SH300239.01 ل-جلوتامين جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة SH30034.01 هيبس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة SH30237.01 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيجما ألدريتش F7524