$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
فئة
1. تمايز واستقطاب الخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة
- استخدم التصاق البلاستيك لعزل الخلايا الوحيدة. باختصار ، قم بزرع خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعزولة حديثا (PBMCs) في صفيحة مزرعة مكونة من 6 آبار بتركيز مناسب ، على سبيل المثال ، 10 × 106 PBMCs / بئر في وسط RPMI خال من المصل 2 مل (مكمل RPMI 1640 مع 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 2 ملي مولار ل-جلوتامين و 10 ملي مولار HEPES) وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- بعد 2-3 ساعات ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة بماصة واغسل الآبار 3 مرات بوسط خال من المصل 1 مل. الخلايا المرفقة عبارة عن خلايا وحيدة وتشكل حوالي 10٪ من إجمالي PBMCs المضافة إلى البئر ، أي 106 خلايا وحيدة تم استردادها من 10 × 106 PBMCs المضافة لكل بئر.
- لتمايز البلاعم ، قم بإعداد محلول عمل يحتوي على 50 نانوغرام / مل لتر GM-CSF أو M-CSF لاستقطاب البلاعم M1 و M2 على التوالي ، يضاف في 2 مل من وسط RPMI الكامل لكل بئر. استزراع الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
- في اليوم 3 ، قم بإزالة 1 مل من وسط زراعة الخلايا بعناية من الطبقة العليا لكل بئر واستكمال مزارع الخلايا ب 1 مل من وسط RPMI الكامل الطازج الذي يحتوي على تركيز مزدوج من M-CSF أو GM-CSF للحصول على تركيز نهائي 50 نانوغرام / مل في الآبار. أضف عوامل النمو في محلول عمل معد مسبقا بسعة 100 نانوغرام / مل / بئر.
- في اليوم 6 ، أضف محفزات مختلفة لآخر 18-20 ساعة من تمايز الخلايا للحصول على M1 مستقطب بالكامل وناضج (γ الإنترفيرون. IFN-γ ، وعديد السكاريد الدهني. LPS (الإشريكية القولونية O55: B5)) أو M2 (إنترلوكين 4 ؛ IL-4) الضامة. من أجل استقطاب M1 ، قم بإعداد IFN-γ و LPS في وسط RPMI الكامل (ملحق RPMI 1640 مع 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 2 ملي مولار لجلوتامين ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS)) وأضف 50 ميكرولتر لكل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام / مل IFN-γ و 10 نانوغرام / مل LPS في مزارع الخلايا. بالنسبة لاستقطاب M2 ، قم بإعداد IL-4 في وسط RPMI الكامل وأضف 50 ميكرولتر لكل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 20 نانوغرام / مل في مزارع الخلايا.
- لتمايز البلاعم المستقطبة M0 ، قم بتحفيز الخلايا باستخدام M-CSF فقط ، دون أي سيتوكينات إضافية (توفر نمطا ظاهريا يشبه M2).
- تحقق من مورفولوجيا مزارع الخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة بانتظام باستخدام الفحص المجهري الضوئي للتأكد من تمايز الخلايا الوحيدة الأصغر إلى خلايا أكبر تشبه البلاعم. أيضا ، راقب الاختلافات المورفولوجية المحتملة بين الاستقطاب M1 و M2 ، أي خلايا M1 الممدودة والممتدة مقارنة بخلايا M2 ذات الشكل الأكثر استدارة.