التوليد في المختبر للخلايا المتغصنة البلازمية من الأسلاف اللمفاوية الشائعة

الملخص

المصدر: Chang ، S. ، et al. في المختبر التوليد من الخلايا المتغصنة البلازمية الفئرانية من أسلاف اللمفاوية الشائعة باستخدام نظام التغذية AC-6. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لتوليد الخلايا المتغصنة البلازمية (pDCs) من الخلايا السلفية اللمفاوية الشائعة (CLPs). عند الزراعة المشتركة ل CLPs المنقاة مع خلايا التغذية المشععة γ في وجود ترابط التيروزين كيناز -3 الشبيه ب FMS (FL) ، تتمايز CLPs إلى pDCs غير ملتصقة ، يتم تأكيد وجودها باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير خلايا التغذية AC-6

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يجب الحفاظ على خط الخلايا اللحمية AC-6.21 (AC-6 باختصار) (مقدم من I. Weissman ، جامعة ستانفورد) في RPMI مكمل بنسبة 15٪ من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (FBS). لتكون بمثابة خلايا مغذية ، يتم تشعيع خلايا AC-6 γ ب 3,000 راد (30Gy) قبل يوم واحد من الزراعة المشتركة لمنع انتشارها. لاحظ أن خلايا AC-6 تميل إلى فقدان قدرتها على دعم التمايز إذا تركت مكتظة أثناء الصيانة ، أو إذا كان عدد مرورها أكثر من 20.

1. اغسل خلايا AC-6 مرة واحدة باستخدام 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco وقم بإزالة DPBS عن طريق الشفط. عالج خلايا AC-6 بمحلول التربسين 0.8 مل (0.05٪ تريبسين و 0.5 ملي EDTA في DPBS) لمدة 3-5 دقائق عند 37^درجةمئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ثم أوقف التفاعل عن طريق تخفيفه ب 10 أحجام من وسط الاستزراع لعمل تعليق خلية واحدة.
بذور
2. خلايا AC-6 عند 5.9 × 10⁴ خلايا / بئر في 12 لوحة بئر واحتضانها عند 37^درجةمئوية ، 5٪ CO₂ O / N.
   ملاحظه: تعتبر كثافة خلايا AC-6 مهمة جدا لأن الكثافة المنخفضة ستفضل توليد cDC. سيسمح البذر بكثافة 5.9 × 10⁴ خلايا / بئر ل AC-6 بالوصول إلى التقاء بحلول اليوم التالي ، وهو ما يعد مثاليا لاشتقاق pDCs من CLPs.
3. قم بإشعاع خلايا AC-6 عند 3,000 راديتر (30 جراي) باستخدام γ-irradio.
   ملاحظة: تم تحسين الجرعة المستخدمة لإشعاع AC-6 لمنع الخلايا من التكاثر ومع ذلك إبقائها قابلة للحياة لفترة كافية لتوفير السيتوكينات والاتصال الخلوي الخلوي المطلوب لتمايز DCs من CLPs.
4. استنشق وسط واستبدله ب 1 مل RPMI كامل (RPMI مع FBS 10٪ معطل للحرارة ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 50 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول).

2. عزل خلايا BM من الفئران

1. التضحية بالفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ وخلع عنق الرحم. ضع الفئران على صينية تشريح وعقمها بنسبة 70٪ إيثانول. قم بعمل شق في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء البعيد من الفأر بما في ذلك الجلد الذي يغطي الأطراف السفلية.
2. تشريح الفئران في غطاء شبه معقم. لتحرير عظم الفخذ والساق ، قم بقص عظم الفخذ أعلاه والظنبوب أسفل مفصل الركبة. افصل العضلات عن العظام باستخدام المقص وضع العظام في طبق بتري 6 سم يحتوي على 5 مل RPMI كامل.
3. انتقل إلى غطاء ثقافة معقم. املأ حقنة 3 مل متصلة بإبرة 27G ب RPMI كامل. اقطع طرفي العظام باستخدام المقص ، وأدخل إبرة 27G لطرد النخاع من العظام عن طريق حقن RPMI كامل برفق مرة واحدة من كل طرف.
4. قم بإعداد معلق أحادي الخلية عن طريق سحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل 3-5 مرات في طبق المزرعة باستخدام المحقنة بدون الإبرة.
5. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم وصب المادة الطافية.
6. تحتضن خلايا الدم الحمراء مع 1 مل من المخزن المؤقت ACK (150 ملي مولار NH₄Cl ، 10 ملي مولار KHCO₃ ، 0.1 ملي مولار EDTA) تحتضن لمدة دقيقة واحدة وتوقف التفاعل عن طريق التخفيف ب 10 أحجام من RPMI الكامل. اسمح للخلايا بالوقوف لمدة 5 دقائق من أجل تكسير كتل الخلايا الميتة وحطام الأنسجة عن طريق الجاذبية.
   ملاحظه: لا تقف لأكثر من 5 دقائق لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان الخلايا بسبب استقرار الخلايا القابلة للحياة.
صب
7. ببطء المواد المطفية المحتوية على الخلايا إلى أنبوب جديد تاركا الحطام وراءه في الأنبوب الأصلي.
8. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم لتكسير الخلايا ، ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
9. إعادة تعليق إجمالي خلايا BM (عادة 4-6 × 10 يتم^{الحصول على 7} خلايا BM من فأر واحد) في 100 ميكرولتر FACS buffer (1x PBS + 2٪ FBS + 1 ملي EDTA).

< p class = "jove_title" >3. تحليل FACS وفرز CLPs

1. أضف مضاد CD16 / 32 (استنساخ الورم الهجين الفائق 2.4G2 ، 50 ميكرولتر / تفاعل أو 1-2 ميكروغرام / تفاعل) في الخلايا في المخزن المؤقت FACS (الخطوة 2.9) لمدة 1-2 دقيقة من أجل منع مستقبلات Fc.
   ملاحظه: يطلق على Anti-CD16 / 32 أيضا اسم كتلة Fc ، والتي تضاف لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالخلايا التي تعبر عن مستقبلات Fc بما في ذلك الخلايا الحبيبية والخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية البائية.
قم
2. بتلطيخ الخلايا في نفس الوقت مع الأجسام المضادة التالية المسماة بالصبغة الفلورية (ل 4 × 10⁷ خلايا) لمدة 15 دقيقة على الجليد ، وتجنب الضوء المحيط. الأجسام المضادة: علامات النسب المترافقة ب PE (0.2 ميكروغرام لكل منها) بما في ذلك مضاد CD3 (17A2) ، مضاد CD8 (53-6. 7) ، مضاد B220 (RA3-6B2) ، مضاد ل CD19 (eBio1D3) ، مضاد ل CD11b (M1 / 70) ، مضاد ل Gr-1 (RB6-8C5) ، مضاد ل Thy1.1 (HIS51) ، مضاد ل NK1.1 (PK136) ، مضاد ل TER119 (TER-119) ، ومضاد ل MHC-II (NIMR-4) ، 0.2 ميكروغرام مضاد ل C-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8) ، 1 ميكروغرام مضاد ل Sca-1-FITC (D7) ، 0.4 ميكروغرام مضاد ل M-CSFR-APC (AFS98) ، و 0.2 ميكروغرام مضاد ل IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. اغسل الخلايا بمحلول FACS سعة 3 مل ، وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
4. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت FACS سعة 300 ميكرولتر وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
5. اغسل الأنبوب بمخزن مؤقت إضافي 100 ميكرولتر من FACS لاستعادة أي خلايا متبقية وقم بالتصفية في أنبوب فرز معقم FACS باستخدام نفس مصفاة الخلية.
6. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد التلوين باستخدام المرشحات والفولتية المناسبة للكشف عن الإشارة. استخدم ليزر 488 نانومتر للكشف عن الأجسام المضادة المسماة FITC و PerCP-Cy5.5 ، وليزر 561 نانومتر للكشف عن الأجسام المضادة المسماة PE- و PE-Cy7 ، وليزر 633 نانومتر للكشف عن الجسم المضاد المسمى APC.
7. قم بفرز CLPs وفقا للعلامات التالية: ^{lin-c-kit int}Sca-1^intM-CSFR-IL-7Rα⁺ (كما هو ملون في الخطوة 3.2) باستخدام فارز الخلايا. اجمع الخلايا التي تم فرزها في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من RPMI الكامل كوسادة.
8. سجل العدد المطلق للخلايا التي تم فرزها كما هو موضح بواسطة فارز الخلايا في نهاية التشغيل. عادة ، يمكن الحصول على 5 × 10⁴ CLPs من BM لماوس واحد.

< p class = "jove_title" >4. الزراعة المشتركة CLPs و AC-6

قم
1. بالطرد المركزي للخلايا التي تم فرزها من الخطوة 3.7 لمدة 10 دقائق عند 500 × جم ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بكمية كافية من RPM الكامل للحصول على كثافة خلية تبلغ حوالي 5 × 10⁴ خلايا / مل. قم بزرع 500 خلية / بئر في الصفيحة المكونة من 12 بئرا التي تحتوي على خلايا مغذية محضرة في الخطوة 1.4.
2. أضف 100 نانوغرام / مل FL (hu-Flt3L-Ig تم إنشاؤه داخليا باستخدام نظام تعبير مقدم من M. Manz ، مستشفى جامعة زيورخ ، سويسرا) واحتضانه عند 37^درجةمئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ مع المراقبة البصرية الدورية لتطور التيار المستمر تحت المجهر.
   ملاحظه: يمكن استخدام FL البشري المؤتلف أو الماوس FL المتاح تجاريا كبديل ل hu-Flt3L-Ig لدعم تطوير التيار المستمر.
3. اجمع الخلايا في المادة الطافية في اليوم 12 واغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 0.5 مل من وسط RPMI الكامل الذي يجمع بين المواد الطاففية الناتجة. أضف 0.5 مل من الوسط الطازج وقم بإلغاء الخلايا الملتصقة باستخدام مكشطة الخلية.
4. امزج الوسط المحتوي على الخلية من كلا الجزأين وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
5. صب الخلايا الطافية وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر FACS عازلة. أضف 50 ميكرولتر من الورم الطافي المضاد ل CD16 / 32 واحتضنه لمدة 1-2 دقيقة لمنع مستقبلات Fc.
6. تعداد وصمة عار جميع الخلايا بالأجسام المضادة التالية (0.05 ميكروغرام لكل منها) ، ومضاد CD11c-APC (N418) ، ومضاد CD11b-FITC ، ومضاد B220-PE.
7. اغسل الخلايا وقم بطردها المركزي كما هو موضح في الخطوة 3.3.
8. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS سعة 100 ميكرولتر ، والبوابة على CD11c + ، وقم بتحليلها بحثا عن cDCs (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220^-) و pDCs (CD11c ⁺ CD11b-B220 ⁺).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مضاد للماوس Ly6g / Ly6c (PE) ، استنساخ RB6-8C5 بيوليجند 108408 علامة النسب مضاد للماوس NK1.1 (PE) ، استنساخ PK136 بيوليجند 108708 علامة النسب مضاد للفأر CD11b (PE) ، cloneM1 / 70 بيوليجند 101208 علامة النسب مضاد للفأر CD19 (PE) ، استنساخ eBio1D3 بيوليجند 115508 علامة النسب مضاد للماوس B220 (PE) ، استنساخ RA3-6B2 بيوليجند 103208 علامة الخط / FACS مضاد للفأر CD3 (PE) ، استنساخ 17A2 بيوليجند 100308 علامة النسب مضاد للفأر CD8a (PE) ، استنساخ 53-6.7 بيوليجند 100707 علامة النسب مضاد للفأر MHC-II (PE) ، استنساخ NIMR-4 بيوليجند 107608 علامة النسب مضاد للماوس Ter119 (PE) ، استنساخ TER-119 بيوليجند 116208 علامة النسب مضاد للفأر Thy1.1 (PE) ، استنساخ HIS51 العلوم البيولوجية الإلكترونية 12-0900-83 علامة النسب مضاد للماوس M-CSFR (APC)، استنساخ AFS98 بيوليجند هاتف: 135510 FACS مجموعة C المضادة للماوس (PerCP / Cy5.5) ، استنساخ 2B8 بيوليجند 105824 FACS مضاد للماوس Sca-1 (FITC) ، استنساخ D7 بيوليجند 108106 FACS مضاد للفأر IL-7Ra (PE / Cy7) ، استنساخ A7R34 بيوليجند 135014 FACS CD11c مضاد للماوس (PerCP/Cy5.5)، استنساخ N418 بيوليجند 117328 FACS مضاد للفأر CD11b (FITC) ، استنساخ M1 / 70 بيوليجند 101206 FACS فاكساريا III BD Biosciences فارز الخلايا أنبوب الفرز FACS BD Biosciences 352054 فلولجو فلونجو ذ.م.م برامج تحليل التدفق