توليد الخلايا المتغصنة غير الناضجة والناضجة والتحمل من الخلايا الوحيدة

الملخص

المصدر: Sim، W.J. et al.، جيل من الخلايا المتغصنة غير الناضجة والناضجة والتوليروجينيك ذات الأنماط الظاهرية الأيضية المختلفة.J. Vis. Exp.(2016).

يوضح هذا الفيديو توليد الخلايا المتغصنة غير الناضجة والناضجة والتحمل ، أو DCs ، من الخلايا الوحيدة البشرية. يؤدي حضانة الخلايا الوحيدة مع عوامل النمو والسيتوكينات إلى إنتاج DCs غير ناضجة. استجابة للجزيئات التنظيمية المناعية ، تتمايز DCs غير الناضجة إلى DCs تحلل وناضجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs)

1. تحضير الكاشف
   1. تحضير PBS / EDTA: محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ومكملات بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك 2 ملي مولار (EDTA). قم بتعقيم هذا المحلول عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. ملاحظة لتخزين PBS / EDTA عند 4 درجات مئوية وتسخينها إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
   2. تحضير محلول تلطيخ المخزن المؤقت: مكمل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع مصل بقري جنين 2٪ (FBS) ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك (HEPES) ، و 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). قم بتعقيم هذا المحلول عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
2. جمع الدم من مخروط الدم
   ملاحظه: يحتوي مخروط الدم على مكونات خلايا الدم البيضاء التي تم جمعها بعد فصادة الصفائح الدموية من المستشفى. إذا تم جمع الدم في أنابيب الهيبارين أو EDTA ، فقم بتخفيف الدم باستخدام PBS بنسبة 1: 1 وانتقل إلى الخطوة 1.3 ؛ إذا تم تلقي معطف مصفر، فقم بتخفيف الطبقة المصفرية باستخدام PBS بنسبة 1: 2 وانتقل إلى الخطوة 1.3.
   1. اقطع طرفي المخروط للسماح للدم بالتدفق إلى أنبوب سعة 50 مل.
      لاحظ أن المخروط يحتوي عادة على 10 مل من الدم.
   2. استخدم حقنة حادة تحتوي على 30 مل من PBS / EDTA لغسل المخروط وتجميعه في أنبوب سعة 50 مل.
   قم
   3. بتخفيف الدم بشكل أكبر باستخدام PBS / EDTA إلى الحجم النهائي 80 مل.
3. عزل PBMCs عن طريق الطرد المركزي الكثافة
   1. Aliquot 15 مل Ficoll لكل منها 4 أنابيب طازجة سعة 50 مل.
   2. استخدم ماصة مصلية سعة 25 مل لإضافة 20 مل من الدم المخفف فوق طبقة فيكول. لاحظ أن تمسك الأنبوب سعة 50 مل بزاوية 45 واحرص على عدم إزعاج الطور البيني.
   3. الطرد المركزي الأنابيب عند 805 × جم بدون فرامل لمدة 30 دقيقة ، 20 درجة مئوية.
   4. قم بإزالة طبقة البلازما واجمع حلقة PBMCs الموجودة أسفل طبقة البلازما مباشرة باستخدام ماصة باستور. اجمع بين أربعة أنابيب من PBMCs في أنبوبين سعة 50 مل. ملاحظة لتجنب تجميع الطبقة الشفافة أسفل PBMCs.
   5. أضف PBS / EDTA إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل لكل أنبوب من PBMCs وأجهزة الطرد المركزي عند 548 × جم مع الفرامل لمدة 10 دقائق ، 20 درجة مئوية.
   6. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في كل أنبوب مع 25 مل من محلول التلوين واجمعها في أنبوب واحد سعة 50 مل.
   7. جهاز طرد مركزي عند 367 × جم مع فرامل لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية.
   8. شفط الطاف وإعادة تعليق الحبيبات مع 10 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ.

< p class = "jove_title" >2. تخصيب الخلايا الأحادية عن طريق الفصل المغناطيسي

1. تحديد رقم الخلية
   1. خذ 20 ميكرولتر من معلق خلية PBMC واخلطه مع 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق لحساب عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس الخلوي.
   2. تعليق خلية الطرد المركزي عند 367 × جم مع فرامل لمدة 10 دقائق ، 4 درجات مئوية.
   3. شفط طافي تماما وإعادة تعليق حبيبات الخلية إلى تركيز 10⁷ خلايا لكل 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
2. الملصقات المغناطيسية
   1. أضف 20 ميكرولتر من حبيبات CD14 لكل 10⁷ خلايا ، واخلطها جيدا ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 2-8 درجة مئوية.
   2. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من محلول التلوين لكل 10⁷ خلايا وجهاز طرد مركزي عند 367 × جم مع الفرامل لمدة 10 دقائق و 4 درجات مئوية.
   3. شفط المادة الطافية تماما وإعادة تعليق حبيبات الخلية بتركيز 10⁷ خلايا لكل 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
3. الفصل المغناطيسي
   1. استخدم عمودا متوسط الحجم بحد أقصى 2 × 10⁸ خلايا إجمالية.
      ملاحظه: اختر عمودا وفاصلا مناسبين وفقا لعدد الخلايا الإجمالية وعدد خلايا CD14⁺ الموصى بها في ورقة البيانات.
   2. ضع العمود في المجال المغناطيسي لفاصل مناسب وقم بإعداد العمود عن طريق شطفه ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
   3. تعليق خلية الماصة على العمود وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود بأنبوب سعة 15 مل.
   4. استبدل أنبوبا جديدا سعة 15 مل أسفل العمود واغسل العمود 3 مرات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. تأكد من أن خزان العمود فارغ قبل إضافة مخزن مؤقت جديد للتلطيخ بين الغسيل.
   5. قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب جديد سعة 15 مل.
   6. ماصة 1 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ على العمود. قم على الفور بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة (المتوفرة في المجموعة) في العمود.
   7. كرر الخطوات من 2.3.2 إلى 2.3.6 باستخدام الكسر المشطوب في عمود جديد لزيادة نقاء خلايا CD14 +. لاحظ أنه سيتم إطلاق الخرزات من الخلايا تلقائيا في الثقافة خلال الخطوة 3.2.

< p class = "jove_title" >3. تمايز الخلايا المتغصنة إلى حالات تنشيط مختلفة

1. تحضير الكاشف (يجب أن يكون مستوى السموم الداخلية أقل من 0.1 يورو / مل في جميع الكواشف)
   1. تحضير وسط زراعة الخلايا: RPMI 1640 مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، و 0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول (2ME). قم بتعقيم هذا المحلول عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
   2. تحضير السيتوكينات: إعادة تكوين IL-4 و GM-CSF في ماء من درجة زراعة الخلايا بتركيز 0.25 مجم / مل على التوالي في ظل ظروف معقمة. Aliquot السيتوكينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 200 ميكرولتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
   3. تحضير مخزون فيتامين د 3: أعد تكوين فيتامين د 3 في ماء من درجة زراعة الخلايا بتركيز 100 ملي مولار في ظل ظروف معقمة. Aliquot فيتامين D3 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   4. تحضير مخزون ديكساميثازون: أعد تكوين ديكساميثازون في ماء من الدرجة المستزرعة الخلوية بتركيز 10 ملي مولار في ظل ظروف معقمة. Aliquot ديكساميثازون في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   5. تحضير LPS: إعادة تكوين عديدات السكاريد الدهنية (LPS) في ماء من الدرجة المزروعة الخلوية بتركيز 1 مجم / مل في ظل ظروف معقمة. Aliquot LPS في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2. توليد موتيكاث مختلفة
   1. بذرة 4 مجموعات من الخلايا الوحيدة CD14 ⁺ بتركيز 0.3 - 0.5 × 10⁶ / مل من وسط زراعة الخلايا مع 200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4 في 6 ألواح آبار. لاحظ أن هذا هو اليوم 0 وحجم الوسط في كل 6 بئر هو 2 مل.
   2. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   3. قم بإزالة 850 ميكرولتر من الوسط من المزرعة في اليوم 4 وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 2x من (200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4). أضف خليط الخلية هذا مرة أخرى إلى المزرعة. لاحظ أن تركيز 2x المضاف ل GM-CSF و IL-4 سيصبح 1x عند إضافة 1 مل من الوسط مرة أخرى إلى المزرعة.
   4. أضف 1 ميكرولتر من مخزون فيتامين D3 و 1 ميكرولتر من مخزون الديكساميثازون لكل مل من المتوسط إلى مجموعتين من المجموعات في اليوم 5 لتوليد moDCs لتوليد التحمل لاحظ أن التركيز النهائي لفيتامين D3 هو 100 نانومتر وديكساميثازون هو 10 نانومتر. إضافة GM-CSF و IL-4 غير مطلوبة في اليوم 5.
   5. أضف 200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4 إلى جميع المجموعات في اليوم 6.
   6. أضف 1 ميكروغرام / مل من LPS إلى إحدى المجموعات المعالجة ب GM-CSF و IL-4 فقط في اليوم 6 لتوليد moDCs ناضجة.
   7. أضف 1 ميكروغرام / مل من LPS إلى مجموعة واحدة من moDCs ذات التحمل في اليوم 6 لإنشاء moDCs ذات تحمل LPS.
   8. احصد الأنواع المختلفة من moDCs في اليوم 7 عن طريق شطف طبق الاستزراع باستخدام PBS أو EDTA لقياس التدفق الخلوي أو دراسات أخرى. لاحظ أنه يتم حصاد الخلايا غير الملتصقة فقط. لاحظ أن النسبة المئوية للعائد من الخلايا الوحيدة CD14⁺ ل moDCs غير الناضجة ، و moDCs الناضجة ، و moDCs التحملية ، و LPS ، و LPS ، تبلغ حوالي 90٪ و 50٪ و 60٪ و 60٪ على التوالي ، وتختلف بين المتبرعين بالدم و FBS lot.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فيكول جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-03 عزل PBMC حقنة بيكتون ، ديكنسون 302832 عزل PBMC أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل أكسايجن MCT-150-C عزل PBMC أنبوب الصقر 15 مل صقر 352096 عزل PBMC 50 مل أنبوب الصقر صقر 352070 عزل PBMC الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص عزل PBMC مرشح 0.2 ميكرومتر Sartorius stedim التكنولوجيا الحيوية 17597 عزل PBMC طقم MACs ميلتيني بيوتيك 130-042-201 تخصيب الخلايا الأحادية فاصل MiniMACS ميلتيني بيوتيك 130-042-102 تخصيب الخلايا الأحادية مياه من الدرجة المزروعة الخلوية Invitrogen ، تقنيات الحياة زراعة الخلايا RPMI جيبكو ، لايف تكنولوجيز 11875-093 زراعة الخلايا FBS هيكلون SH30070103 زراعة الخلايا البنسلين - ستربتومايسين جيبكو ، لايف تكنولوجيز 15140 زراعة الخلايا محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو ، لايف تكنولوجيز 10010-031 زراعة الخلايا NEAA جيبكو ، لايف تكنولوجيز 11140-040 زراعة الخلايا EDTA جيبكو ، لايف تكنولوجيز 15575 [م] زراعة الخلايا هيبس جيبكو ، لايف تكنولوجيز هاتف: 15630-080 زراعة الخلايا بيروفات الصوديوم جيبكو ، لايف تكنولوجيز هاتف: 11360-070 زراعة الخلايا GM-CSF ميلتيني بيوتيك 130-093-868 زراعة الخلايا IL-4 ميلتيني بيوتيك 130-093-924 زراعة الخلايا فيتامين د 3 سيغما د1530 زراعة الخلايا ديكساميثازون سيغما د2915 زراعة الخلايا لبس سيغما L2755 زراعة الخلايا تريبان بلو جيبكو ، لايف تكنولوجيز 15250-061 زراعة الخلايا