عزل وتنقية الخلايا البائية من الدم المحيطي البشري

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tzeng، S. J. عزل وتمايز وقياس الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة البشرية من الدم: ELISpot كقراءة وظيفية للمناعة الخلطية. J. Vis. Exp. (2016)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا البائية عن الدم المحيطي البشري باستخدام الأجسام المضادة البيوتينيل الخاصة بالخلايا غير البائية والميكروبيدات المغناطيسية المترافقة بالستربتافيدين.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسي المحلي

< p class = "jove_title" >1. عزل وتنقية خلايا الدم البائية المحيطية البشرية

1. اسحب ~ 10 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط (في الحفرة المرفقية الأمامية للكوع) إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على K₂EDTA (1.5 إلى 2.0 مجم / مل من الدم) وقم بقلب الأنبوب على الفور عدة مرات لمنع تكوين الجلطة.
2. أضف 35 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة) (150 ملي NH₄Cl و 10 ملي مولار KHCO₃ و 1 ملي مولار EDTA ؛ درجة الحموضة 7.4) إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة الدم الطازجة (≥ 3: 1 حجم / حجم) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق
   ملاحظه: يشير ظهور انتقال الضوء عبر الأنبوب إلى اكتمال تحلل كرات الدم الحمراء.
3. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
4. أعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من محلول ملحي معقم التخزين بالفوسفات (PBS ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.3 ملي مولار Na₂HPO₄ ، و 1.47 ملي مولار KH₂PO₄ ؛ درجة الحموضة 7.4) وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.3.
5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من وسط RPMI 1640 (المكملات الغذائية: 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية ، 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، و 2 ملي لتر جلوتامين) ، ثم ضع الخلايا في طبق مزرعة 10 سم (10 مل من الدم لكل طبق). ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة.
6. قم بتدوير طبق الثقافة برفق عدة مرات وضع وسط الثقافة (خلايا التعليق) في أنابيب بلاستيكية مخروطية سعة 15 مل. تخلص من الخلايا الملتصقة (معظمها من البلاعم) على أطباق الاستزراع.
7. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
8. أعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من وسط RPMI 1640. احسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
   ملاحظه: عادة ما تكون صلاحية الكريات البيض المعزولة أكبر من 90٪ عن طريق استبعاد التريبان الأزرق.
9. جهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 1.7 وإعادة تعليق الخلايا في ~ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS البارد (0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 2 ملي مولار EDTA) بتركيز 5 - 10 × 10⁶ خلايا / مل.
10. أضف 5 ميكرولتر من كوكتيل Ab المضاد للإنسان البيوتينيل الخاص بخلايا الدم (للاختيار السلبي للخلايا البائية) لكل 10⁶ خلايا واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة < br / > ملاحظه: يجب أن يشتمل كوكتيل Ab المضاد للإنسان على الأقل على عضلات البطن الخاصة ب CD2 (أو CD3) و CD14 و CD16.
11. أضف حجما زائدا بمقدار 10 أضعاف من PBS المعقم إلى الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
12. أضف كميات متساوية من الميكروبيدات المترافقة بالستربتافيدين (5 ميكرولتر لكل 10⁶ خلايا) إلى الحبيبات واخلطها جيدا.
13. احتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة في أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 مل.
14. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBS إلى الأنبوب.
15. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي واحتضنه عند RT لمدة 8 دقائق. سوف تلتصق الميكروبيدات البنية تدريجيا بجدار الأنبوب بجوار المغناطيس.
16. مع بقاء الأنبوب في الحامل المغناطيسي ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 مل.
17. كرر الخطوات من 1.14 إلى 1.16 واجمع بين الاثنين من المواد الطافية التي تحتوي على الخلايا البائية التي لم تمسها. تجاهل الميكروبيدات.
18. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
19. أعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI 1640 للتجارب النهائية.
    ملاحظه: عادة ، يمكن عزل 1-5 × 10⁵ خلايا ب بنقاء أكبر من 95٪ من 10 مل من الدم المحيطي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BD مكنسة كهربائية K2E BD Biosciences 367525 أنبوب 10 مل فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-02 خال من السموم الداخلية محلول تريبان بلو 0.5٪ الصناعات البيولوجية 03-102-1 ب صبغ IMag مجموعة تخصيب الخلايا الليمفاوية البشرية B BD Biosciences 558007 الكاشف الميكروبيدات المغناطيسية ستربتافيدين BD Biosciences 9000810 الكاشف 15 مل أنابيب فالكون بي دي فالكون 352196 أدوات بلاستيكية بيوتينيل CD27 مللي أمبير بيوليجند 302804 استنساخ O323 البيوتينيل مضاد للإنسان CD27 بيوليجند 302804 استنساخ O323 البيوتينيل مضاد للإنسان CD27 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0279-80 استنساخ O323