Method Article

فرز الخلايا القائم على قياس التدفق الخلوي لمجموعات مختلفة من الخلايا البائية في الدورة الدموية

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Tzeng، S. J. عزل وتمايز وقياس الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة البشرية من الدم: ELISpot كقراءة وظيفية للمناعة الخلطية. J. Vis. Exp. (2016).

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا للفرز القائم على قياس التدفق الخلوي للخلايا البائية الساذجة وخلايا الذاكرة B وخلايا البلازما الصغيرة من خلايا الدم البدي المحيطية البشرية. يمكن تمييز المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للخلايا البائية بناء على ارتباط الأجسام المضادة القائمة على الفلوروفور بمستقبلات CD19 و CD27 و CD38 المعبر عنها على أسطح الخلايا البائية ، متبوعا بفرز الخلايا.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. فرز الخلايا لجمع الخلايا البائية الساذجة ، وخلايا الذاكرة B ، وأرومات البلازما / خلايا البلازما (PBs / PCs)

  1. باستخدام خلايا الدم البائية المحيطية البشرية المنقاة ، حدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت بارد PBS بتركيز 107 لكل مل في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل.
  3. أضف 1 - 2 ميكروغرام من IgG البشري لكل 106 خلايا واحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق لكتلة Fc.
  4. أضف 1 ميكروغرام لكل من anti-CD19-APC (استنساخ: HIB19) ، ومضاد CD27-eFluor450 (استنساخ: O323) ، ومضاد CD38-PE (استنساخ: HIT2) لكل 106 خلايا ؛ اخلطي جيدا وحتضنيه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  5. في آخر 5 دقائق في الخطوة 1.4 ، أضف 5 ميكرولتر من 7 أمينو أكتينومايسين D التجاري (7-AAD).
  6. أضف 2 مل من PBS إلى الأنبوب والدوامة وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للفرز (PBS معقم مع 2٪ BSA و 2 ملي مولار EDTA) بتركيز 1-5 × 107 خلايا لكل مل في أنبوب سعة 15 مل.
  8. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون (حجم المسام 40 ميكرومتر) للقضاء على كتل الخلايا.
  9. افصل الخلايا باستخدام فارز التدفق الخلوي المجهز بثلاثة أنواع من الليزر: البنفسجي (405 نانومتر) والأزرق (488 نانومتر) والأحمر (640 نانومتر).
    ملاحظة: الليزر الأزرق وحده كاف لقياس التدفق الخلوي ب 3 ألوان.
  10. قم بفرز الخلايا إلى ثلاثة أنابيب سعة 15 مل (تحتوي على 5 مل من وسط RPMI) للتجميع المتزامن للخلايا البائية الساذجة (CD19 + CD27-) ، وخلايا الذاكرة B (CD19 + CD27 +) ، و PBs / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
    ملاحظه: يمكن زراعة الخلايا البائية الساذجة والذاكرة المصنفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 15 مل أنابيب فالكون بي دي فالكون 352196 مصفاة خلية شبكية من النايلون الأزرق ، 40 ميكرومتر بي دي فالكون هاتف: 352340 مكافحة الإنسان CD19-APC بيوليجند 302212 استنساخ HIB19 مضاد للإنسان CD27-eFluor 450 العلوم البيولوجية الإلكترونية 48-0279-42 استنساخ O323 مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7 بيوليجند 303516 استنساخ HIT2 مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 استنساخ HIT2 مضاد للإنسان CD45-FITC بيوليجند 304006 استنساخ HI30 مضاد للإنسان CD45-FITC BD Biosciences 555482 استنساخ HI30 مضاد للفأر / الفئران / الإنسان CD27- PerCP Cy5.5 بيوليجند 124213 استنساخ LG.3A10 مضاد للإنسان CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 استنساخ L128 مضاد للإنسان CD19-FITC ميلتيني بيوتيك 130-098-064 استنساخ LT19 مضاد للإنسان CD19-FITC جينيتكس GTX75599 استنساخ LT19 مضاد للإنسان CD20-FITC BD Biosciences 555622 استنساخ 2H7 7-أمينوأكتينومايسين د (7-AAD) BD Biosciences 559925 IgG البشري جاكسون للأبحاث المناعية 009-000-003

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell SortingB Cell PopulationsNaive B CellsMemory B CellsPlasmablast Plasma CellsCD19 CD27 CD38Fluorescent AntibodiesDead Cell MarkerFACS Buffer

Related Articles