مقالة منهجية

التقييم الوظيفي للخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة باستخدام اختبار ELISpot

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Tzeng، S. J. عزل وتمايز وقياس الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة البشرية من الدم: ELISpot كقراءة وظيفية للمناعة الخلطية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو استخدام مقايسة ELISpot لتقييم وظيفة الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة ، ASCs. تتفاعل الأجسام المضادة التي تفرزها ASCs مع شظايا الأجسام المضادة متعددة النسيلة المرتبطة بالغشاء ، والتي يتم اكتشافها بواسطة الأجسام المضادة IgG أو IgM المترافقة بالإنزيم. تشير البقعة الملونة المنتجة في كل بئر إلى وجود النمط الإسوي للجسم المضاد المحدد ، والذي يرتبط بالنشاط الإفرازي للخلايا البائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

يجب الحصول على الدم المحيطي البشري من متبرعين أصحاء بموافقة مستنيرة ، ويجب أن يتوافق استخدام عينات الدم مع المبادئ التوجيهية المعتمدة التي وضعتها مجالس المراجعة. في هذه الدراسة ، بروتوكول استخدام دم الإنسان في عرض توضيحي لنتائج قياس التدفق الخلوي (الشكل 1) وفحوصات ELISpot (الشكل 2).

< p class = "jove_title" >1. عزل وتنقية خلايا الدم البائية المحيطية البشرية

  1. اسحب ~ 10 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط (في الحفرة المرفقية الأمامية للكوع) إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على K2EDTA (1.5 إلى 2.0 مجم / مل من الدم) وقم بقلب الأنبوب على الفور عدة مرات لمنع تكوين الجلطة.
  2. أضف 35 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) المعقم (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة) (150 ملي NH4Cl ، 10 ملي مولار KHCO3 ، و 1 ملي مولار EDTA ؛ درجة الحموضة 7.4) إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة الدم الطازجة (≥ 3: 1 حجم / حجم) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
    ملاحظه: يشير ظهور انتقال الضوء عبر الأنبوب إلى اكتمال تحلل كرات الدم الحمراء.
  3. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
  4. أعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من محلول ملحي معقم التخزين بالفوسفات (PBS ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.3 ملي مولار Na2HPO4 ، و 1.47 ملي مولار KH2PO4 ؛ درجة الحموضة 7.4) وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.3.
  5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من وسط RPMI 1640 (المكملات الغذائية: 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية ، 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، و 2 ملي لتر جلوتامين) ، ثم ضع الخلايا في طبق مزرعة 10 سم (10 مل من الدم لكل طبق). ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بتدوير طبق الثقافة برفق عدة مرات وضع وسط الثقافة (خلايا التعليق) في أنابيب بلاستيكية مخروطية سعة 15 مل. تخلص من الخلايا الملتصقة (معظمها من البلاعم) على أطباق الاستزراع.
  7. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
  8. أعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من وسط RPMI 1640. احسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
    ملاحظه: عادة ما تكون صلاحية الكريات البيض المعزولة أكبر من 90٪ عن طريق استبعاد التريبان الأزرق.
  9. جهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 1.7 وإعادة تعليق الخلايا في ~ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS البارد (0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 2 ملي مولار EDTA) بتركيز 5 - 10 × 106 خلايا / مل.
  10. أضف 5 ميكرولتر من كوكتيل Ab المضاد للإنسان البيوتينيل الخاص بخلايا الدم (للاختيار السلبي للخلايا البائية) لكل 106 خلايا واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة < br / > ملاحظه: يجب أن يشتمل كوكتيل Ab المضاد للإنسان على الأقل على عضلات البطن الخاصة ب CD2 (أو CD3) و CD14 و CD16.
  11. أضف حجما زائدا بمقدار 10 أضعاف من PBS المعقم إلى الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  12. أضف كميات متساوية من الميكروبيدات المترافقة بالستربتافيدين (5 ميكرولتر لكل 106 خلايا) إلى الحبيبات واخلطها جيدا.
  13. احتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة في أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 مل.
  14. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBS إلى الأنبوب.
  15. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي واحتضنه عند RT لمدة 8 دقائق. سوف تلتصق الميكروبيدات البنية تدريجيا بجدار الأنبوب بجوار المغناطيس.
  16. مع بقاء الأنبوب في الحامل المغناطيسي ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 مل.
  17. كرر الخطوات من 1.14 إلى 1.16 واجمع بين الاثنين من المواد الطافية التي تحتوي على الخلايا البائية التي لم تمسها. تجاهل الميكروبيدات.
  18. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
  19. أعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI 1640 للتجارب النهائية.
    ملاحظه: عادة ، يمكن عزل 1-5 × 105 خلايا ب بنقاء أكبر من 95٪ من 10 مل من الدم المحيطي.
< p class = "jove_title" >2. تنقية وفصل الذاكرة والخلايا البائية الساذجة عن الخلايا البائية المعزولة

  1. استخدم الخلايا المنقاة من الخطوة 1 وحدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS البارد بعد الطرد المركزي عند 600 × جم و RT لمدة 5 دقائق.
  3. أضف 1-2 ميكروغرام من CD27 mAb البيوتينيل لكل 106 خلايا واحتضنه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. أضف 10 مل من المخزن المؤقت PBS إلى الأنبوب وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS.
  6. أضف كميات متساوية من الميكروبيدات المغناطيسية الستربتافيدين (1 - 2 ميكروغرام / 106 خلايا) إلى الخلايا في أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 مل.
  7. تخلط جيدا برفق وتحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  8. أضف 2-3 مل من المخزن المؤقت PBS إلى الأنبوب.
  9. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي واحتضنه عند RT لمدة 8 دقائق للسماح للميكروبيدات البنية بالالتصاق بالجانب الأقرب إلى المغناطيس.
  10. مع وجود الأنبوب في الحامل المغناطيسي ، انقل الكسر الطافي بعناية إلى أنبوب معقم جديد. يحتوي هذا الجزء على الخلايا البائية الساذجة CD27 المخصبة.
  11. أضف 5 مل إلى الأنبوب الذي يحتوي على الميكروبيدات وأعد تعليق الميكروبيدات برفق (أي الجزء المخصب من خلايا ذاكرة CD27 + B).
  12. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند RT لمدة 5 دقائق. قم بتعليق الكريات بوسيط RPMI 1640 للتجارب النهائية.
    ملاحظه: عادة ، يمكن تنقية ~ 30 - 60٪ من الخلايا البائية كخلايا ذاكرة CD27 + من PBMCs لمتبرع سليم.
< p class = "jove_title" >3. فرز الخلايا لمجموعة الخلايا البائية الساذجة وخلايا الذاكرة B و PBs / أجهزة الكمبيوتر

  1. باستخدام الخلايا المنقاة من الخطوة 1 ، حدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت بارد PBS بتركيز 107 لكل مل في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل.
  3. أضف 1 - 2 ميكروغرام من IgG البشري لكل 106 خلايا واحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق لكتلة Fc.
  4. أضف 1 ميكروغرام لكل من anti-CD19-APC (استنساخ: HIB19) ، ومضاد CD27-eFluor450 (استنساخ: O323) ، ومضاد CD38-PE (استنساخ: HIT2) لكل 106 خلايا ؛ اخلطي جيدا وحتضنيه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  5. في آخر 5 دقائق في الخطوة 3.4 ، أضف 5 ميكرولتر من 7 أمينو أكتينومايسين D التجاري (7-AAD).
  6. أضف 2 مل من PBS إلى الأنبوب والدوامة وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للفرز (PBS معقم مع 2٪ BSA و 2 ملي مولار EDTA) بتركيز 1-5 × 107 خلايا لكل مل في أنبوب سعة 15 مل.
  8. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون (حجم المسام 40 ميكرومتر) للقضاء على كتل الخلايا.
  9. افصل الخلايا باستخدام فارز قياس التدفق الخلوي المجهز بثلاثة ليزر: البنفسجي (405 نانومتر) والأزرق (488 نانومتر) والأحمر (640 نانومتر).
    ملاحظه: الليزر الأزرق وحده كاف لقياس التدفق الخلوي ب 3 ألوان.
  10. قم بفرز الخلايا إلى ثلاثة أنابيب سعة 15 مل (تحتوي على 5 مل من وسط RPMI) للجمع المتزامن للخلايا البائية الساذجة (CD19 + CD27-) ، وخلايا الذاكرة B (CD19 + CD27 +) ، و PBs / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + / hiCD38 +). < / > ملاحظه: يمكن زراعة الخلايا البائية الساذجة والذاكرة المصنفة كما هو موضح في الخطوة 4.
فئة

4. التمايز في المختبر للخلايا البشرية المعزولة CD19 + B ، وخلايا الذاكرة B CD19 + CD27 + ، و CD19 + CD27- الخلايا البائية الساذجة

  1. باستخدام الخلايا المنقاة في الخطوات 1.19 و 2.10 و 2.11 و 3.10 ، حدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. أعد تعليق الخلايا بوسط RPMI 1640 بتركيز 1-10 × 105 لكل مل وقم بتقسيمها في آبار صفيحة 12 بئرا.
  3. أضف CpG (ODN 2006) عند 5 ميكروغرام / 106 خلايا / مل.
  4. زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 أيام.
  5. احصد الخلايا من كل بئر ، وضعها بشكل منفصل في أنابيب سعة 15 مل ، وأضف 5 مل من PBS إلى كل أنبوب ، وقم بطردها عند 600 × جم و RT لمدة 5 دقائق.
  6. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي. أعد تعليق الخلايا بتركيز 1 - 10 × 105 لكل مل مع وسط RPMI 1640.
< p class = "jove_title" >5. فحص ELISpot

  1. أضف 30 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 35٪ في الماء المقطر إلى كل بئر من ألواح ELISpot لمدة 30 ثانية
    ملاحظه: عند سحب العينة ، تجنب لمس الغشاء في الآبار في جميع الأوقات.
  2. اقلب ألواح ELISpot لإزالة الإيثانول.
  3. ضع 150 ميكرولتر من ddH2O المعقمة في كل بئر واحتضنها في RT لمدة 5 دقائق لطرد الإيثانول المتبقي ؛ اتبعه بغسل PBS المعقم في RT لمدة 3 دقائق
    ملاحظه: قد تكون الخطوات من 5.1 إلى 5.3 اختيارية ، اعتمادا على تصنيع الألواح.
  4. ضع 50 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل من جزء متعدد النسيلة F (ab') 2 من Ig المضاد للإنسان (IgG + IgM + IgA) (في PBS) في كل بئر من ألواح ELISpot واحتضنها عند 4 درجات مئوية طوال الليل (مفضل) أو 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    ملاحظه: أغلق حواف الألواح باستخدام Parafilm حتى الاستخدام.
  5. اقلب الألواح لإزالة عضلات البطن غير المنضمة ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر ، واحتضنها مرتين في RT لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  6. أضف 200 ميكرولتر من PBS مع 5٪ BSA (أو RPMI 1640 متوسط) إلى كل بئر للسد ، واحتضنها في RT لمدة ساعتين.
  7. اقلب الألواح لإزالة المخزن المؤقت للحظر. اغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS ، كما في الخطوة 5.5.
  8. أضف 100 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
  9. عندما تكون جاهزا لبذر الخلايا ، اقلب الألواح لإزالة وسط RPMI 1640.
  10. بذور 100 ميكرولتر (5 × 104) و 50 ميكرولتر (2.5 × 104) و 25 ميكرولتر (1.25 × 104) من الخلايا (من الخطوات 1.19 و 2.10 و 2.11 و 3.10 و 4.6) في آبار صفيحة ELISpot. مع وسيط RPMI 1640 ، ارفع الحجم إلى 150 ميكرولتر / بئر. < / > ملاحظه: يوصى بتخفيف تسلسلي واحد أو اثنين على الأقل من الطحين لطلاء الخلايا.
  11. احتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 8 - 14 ساعة. تجنب تحريك الألواح أثناء الحضانة.
  12. اقلب اللوحات لإزالة الخلايا ووسط RPMI 1640.
  13. أضف 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T (PBS مع 0.05٪ Tween 20) واحتضنها 5 مرات في RT ، كل مرة لمدة 3 دقائق. اقلب اللوحة لإزالة مخزن الغسيل المؤقت بين كل من الغسلات الخمسة.
  14. أضف إما الفوسفاتيز القلوي IgG المضاد للإنسان (AP) ، أو Abs الخاص ب Fcγ (للكشف عن IgG ، 1: 5,000 في PBS-T) أو الماعز المضاد للإنسان IgM-AP ، و Fcμ Fragment-Fragment Abs (للكشف عن IgM ، 1: 5,000 في PBS-T) في الآبار المخصصة واحتضانها في RT لمدة ساعتين في الظلام.
  15. اغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS ، كما في الخطوة 5.5.
  16. أضف 50 ميكرولتر / بئر من محلول الركيزة بروموكلورويندوليل فوسفات نيترو الأزرق تيترازوليوم (BCIP / NBT). تظهر البقع الأرجوانية اللون عادة في 5-15 دقيقة.
  17. أضف 100 ميكرولتر / بئر من ddH2O لمنع التطور المفرط للبقع.
  18. شطف اللوحات بماء الصنبور الجاري بعد التطور الكامل لجميع البقع.
  19. قم بإزالة التصريف السفلي للألواح واتركها تجف في الهواء في الظلام.
  20. عد البقع باستخدام قارئ لوحة آلي مع وحدة الحصول على / تحليل الصور (على سبيل المثال ، ماسح ضوئي آلي أو يدويا عبر مجهر تشريح).
    ملاحظه: يمكن تخزين اللوحات في RT في الظلام وتحليلها لاحقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. رسم توضيحي لاستراتيجية البوابات لفصل الخلايا البائية الساذجة وخلايا الذاكرة B و PBs في PBMCs. (أ) تم تلطيخ الخلايا (2 × 106) ب 2 ميكروغرام لكل من CD19-APC و CD27-eFluor450 و CD38-PE mAbs (الخطوة 3.4). كانت حجرة الخلايا الليمفاوية مسورة (G1) على المخطط النقطي للتشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC). (ب) تم استبعاد مزدوجات الخلية ، التي تتكون من خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BD مكنسة كهربائية K2E BD Biosciences 367525 أنبوب 10 مل فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-02 خال من السموم الداخلية محلول تريبان بلو 0.5٪ الصناعات البيولوجية 03-102-1 ب IMag مجموعة تخصيب الخلايا الليمفاوية البشرية B BD Biosciences 558007 بيوتينيل CD27 مللي أمبير بيوليجند 302804 استنساخ O323 الميكروبيدات المغناطيسية ستربتافيدين BD Biosciences 9000810 15 مل أنابيب فالكون بي دي فالكون 352196 مصفاة خلية شبكية من النايلون الأزرق ، 40 ميكرومتر بي دي فالكون هاتف: 352340 مكافحة الإنسان CD19-APC بيوليجند 302212 استنساخ HIB19 مضاد للإنسان CD27-eFluor 450 العلوم البيولوجية الإلكترونية 48-0279-42 استنساخ O323 مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7 بيوليجند 303516 استنساخ HIT2 مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 استنساخ HIT2 مضاد للإنسان CD45-FITC بيوليجند 304006 استنساخ HI30 مضاد للإنسان CD45-FITC BD Biosciences 555482 استنساخ HI30 مضاد للماوس / الفئران / الإنسان CD27-PerCP Cy5.5 بيوليجند 124213 استنساخ LG.3A10 مضاد للإنسان CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 استنساخ L128 مضاد للإنسان CD19-FITC ميلتيني بيوتيك 130-098-064 استنساخ LT19 مضاد للإنسان CD19-FITC جينيتكس GTX75599 استنساخ LT19 مضاد للإنسان CD20-FITC BD Biosciences 555622 استنساخ 2H7 البيوتينيل مضاد للإنسان CD27 بيوليجند 302804 استنساخ O323 البيوتينيل مضاد للإنسان CD27 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0279-80 استنساخ O323 7-أمينوأكتينومايسين د (7-AAD) BD Biosciences 559925 CpG (ODN 2006) إنفيفوجين TLRL-2006 النوع ب CpG IL-2 البشري المؤتلف بيبروتك 200-02 المؤتلف البشري IL-10 بيبروتك 200-10 المؤتلف البشري IL-21 بيبروتك 200-21 مؤتلف الإنسان sCD40L بيبروتك 310-02 البروتين أ من المكورات العنقودية الذهبية كوان (SAC) سيجما ألدريتش 82526 ميتوجين بوكيويد (PWM) سيجما ألدريتش L9379 لوحات تصفية متعددة الشاشات، حجم المسام 0.45 ميكرومتر ميرك ميليبور MSIPS4510 لوحة ترشيح معقمة وشفافة سعة 96 بئرا مع غشاء PVDF كاره للماء حل BCIP / NBT سيجما ألدريتش ب 6404 كاشف أحادي BCI / NBT ، ركيزة الفوسفاتيز القلوية ميرك ميليبور ES006 IgG البشري جاكسون للأبحاث المناعية 009-000-003 IgG البشري ، جزء Fc جاكسون للأبحاث المناعية 009-000-008 F (ab') 2 جزء من Ig الماعز المضاد للإنسان (IgG + IgM + IgA) جاكسون للأبحاث المناعية 109-006-127 الفوسفاتيز القلوي IgG المضاد للإنسان ، جزء Fcγ خاص جاكسون للأبحاث المناعية 109-055-008 الفوسفاتيز القلوي IgM المضاد للإنسان ، جزء Fcμ محدد جاكسون للأبحاث المناعية 109-055-095 الماعز المضاد للإنسان IgG-peroxidase ، جزء Fcγ محدد جاكسون للأبحاث المناعية 109-035-008 الماعز المضاد للإنسان IgM-peroxidase ، جزء Fcμ محدد جاكسون للأبحاث المناعية 109-035-095 طقم الركيزة BD ELISPOT AEC BD Biosciences 551951 CTL محلل ImmunoSpot سي تي إل

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CpG ODN 2006 RPMI PBS BCIP NBT

مقالات ذات صلة