عزل واستزراع الخلايا اللحمية لنخاع العظام من الساق الفأر

الملخص

المصدر: Maridas, D.E., et al. عزل وثقافة وتمايز الخلايا اللحمية لنخاع العظام وأسلاف ناقضات العظم من الفئران. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل واستزراع الخلايا اللحمية لنخاع العظم من العظام الطويلة للفئران. يمكن استخدام BMSCs الملتصقة المعزولة لمزيد من التحليل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. حصاد العظام من الفئران

1. قتل باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   ملاحظه: تأكد من استخدام من نفس الجنس ويفضل أن تكون من نفس العمر. نستخدم بشكل روتيني التي تتراوح أعمارها بين 7 و 8 أسابيع. نوصي بتجميع الخلايا من 3 على الأقل لكل مجموعة تجريبية للحصول على مجموعة خلايا تمثيلية وقابلة للتكاثر بشكل أفضل.
2. ضع الفأر القتل الرحيم على ظهره على لوح تشريح. استخدم الملقط لإنشاء خيمة من الجلد على البطن. قم بعمل شق صغير (حوالي 1 سم) باستخدام مقص تشريح معقم. قشر الجلد باتجاه الأطراف والقدمين من الجرح لكشف أسفل البطن والساقين.
   1. قطع أسفل مفصل الكاحل لإزالة القدم. قطع على طول القمة الحرقفية عند الورك لفصل رأس عظم الفخذ عن عظم الورك. بينما لا يزال الفأر على ظهره ، قم بعمل شق في منتصف عظم الورك لفصل العظمتين الحرقفيتين.
3. باستخدام مناديل مبللة خالية من النسالة ، قم بإزالة العضلات بعناية من عظم الفخذ والظنبوب وعظام الحرقفية.
   ملاحظه: إن قطع أكبر قدر ممكن من الأوتار والعضلات من العظام يجعل التنظيف أسرع وأسهل باستخدام المناديل الخالية من النسالة (على سبيل المثال ، مناديل كيم). توخي الحذر عند التلاعب بالعظام لأنها تميل إلى الانكسار بسهولة وقد تزداد هشاشتها مع بعض الأنماط الوراثية.
بمجرد تشريح
4. جميع العينات ، ضعها في PBS على الجليد وانتقل إلى غطاء مزرعة معقم لخطوات العزل المتبقية.
   ملاحظه: سيؤدي العمل بشكل معقم قدر الإمكان إلى تقليل احتمالية التلوث في الثقافات.
5. قم بعمل جروح صغيرة (حوالي 1 إلى 2 مم) في كل من الأطراف القريبة والبعيدة من العظام قبل وضعها في الأطراف المقطعة داخل أنابيب الطرد المركزي.
   ملاحظه: تأكد من قطع كمية كافية بحيث يمكن طرد النخاع ؛ ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب القطع كثيرا حيث تميل مجموعات الخلايا إلى الاختلاف بناء على القرب داخل مساحة النخاع.
6. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تأكد من شطف كل النخاع وحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب سعة 1.5 مل أثناء وجود العظام داخل الإدخالات (إما طرف ماصة 200 ميكرولتر أو أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.75 مل). بمجرد جمع كل النخاع ، قم بإزالة الإدخالات مع العظام من أنابيب التجميع.
   ملاحظه: إذا تم مسح كل النخاع ، فستظهر العظام بيضاء. ومع ذلك ، إذا بقي النخاع في عظام معينة ، فحاول قطع الأطراف مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي.

< p class = "jove_title" >2. تعليق الخلية

1. باستخدام إبرة 25 جم ، اسحب كريات الخلية لأعلى ولأسفل ببطء لتفتيت الكتل ودمج جميع العينات في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل. أضف 10 مل من وسائط استزراع BMSC لكل 500 ميكرولتر من العينات.
2. ضع مرشحا 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتمرير معلق الخلية عبر هذا المرشح لإزالة شظايا العظام المحتملة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. طلاء وثقافة مجموعات مختلطة من خلايا نخاع العظام (إجمالي BMCs)

ملاحظة: يتم زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

1. احسب عدد الخلايا وقم بوضعها عند 1.0 × 10⁶ خلايا / سم² في وسط الاستزراع. اترك 72 ساعة من الثقافة المختلطة للخلايا لتلتصق.
   ملاحظه: نوصي بتخفيف معلق الخلية 20 ضعفا في وسط المزرعة وتخفيفه مرة أخرى باللون الأزرق قبل عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بالنسبة للفئران الذكور C57Bl6 / J البالغة من العمر 7 أسابيع ، فإننا ننتج بشكل روتيني رقم خلية يبلغ حوالي 50 × 10⁶ خلايا ولكن العمر والجنس والسلالة يمكن أن تؤثر على عدد الخلايا بشكل ><كبير. ملاحظه: يجب أن تعلق مجموعة مختلطة من الخلايا في الجزء السفلي من بئر المزرعة.
2. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط جديدة. استمر في تغيير الوسائط كل يومين وتحقق من التقاء. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-100٪ ، تكون جاهزة للتمايز.
   ملاحظه: نظرا لأن هذه الثقافة مختلطة مع كل من BMSCs و HSCs ، يمكن استخدامها مباشرة لتكوين الأرومة العظمية ، وتكوين الشحم وكذلك تكوين العظم.

< p class = "jove_title" >4. طلاء وثقافة السكان المنقسمين من BMSCs (BMSCs الملتصقة)

ملاحظة: يتم زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

1. ضع جميع الخلايا التي تم جمعها من عظم الفخذ والظنبوب والعظام الحرقفية لفأر واحد في طبق استزراع مقاس 10 سم (55 سم² من منطقة الاستزراع).
   ملاحظه: عند تجميع 2-3 فئران C57BL / 6J ، نقوم عادة بوضع مجموعة نخاع العظام "الإجمالية" في قارورة 150 سم².
2. بعد 48 ساعة من الثقافة المختلطة ، قم بإزالة وسائط المزرعة (التي تحتوي على HSCs غير الملتصقة). إذا كان سيتم إجراء تجارب تكوين العظم ، فضع هذه المجموعة من الخلايا غير الملتصقة جانبا (انظر القسم 7) ، إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بشفط هذه الخلايا والتخلص منها.
3. اغسل اللوحة / القارورة باستخدام PBS بعناية حتى لا تزعج الخلايا المرفقة.
4. قم بإزالة PBS ورفع الخلايا عن طريق إضافة 0.25٪ من التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق. في هذه المرحلة ، يمكن حساب BMSCs ، التي تم رفعها الآن ، (كما حدث سابقا في الخطوة 4.1) وطلاءها للتجارب المستقبلية.
5. احسب عدد الخلايا اللازمة للطلاء. جهاز الطرد المركزي الحجم المطلوب لتعليق الخلية عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: عادة ما يتم طلاء الخلايا بناء على تجارب نقطة النهاية. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم عزل البروتين / الحمض النووي الريبي ، فعادة ما يتم عزله بكثافة أعلى (~ 1.0-2.0 × 10⁶ خلايا / بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار).
6. قم بإزالة الوسائط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في حجم وسائط الاستزراع اللازمة للطلاء. قم بوضع الخلايا في وسط الاستزراع وفقا للتجارب واتركها تلتصق لبضعة أيام. عندما تصل BMSCs إلى التقاء ، تابع إجراء التمايز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطراف ماصة 200 ميكرولتر رينين 17014401 الأواني البلاستيكية أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1615-5500 الأواني البلاستيكية أنبوب مخروطي 15 مل VWR 89039-668 الأواني البلاستيكية 50 مل أنبوب مخروطي VWR 89039-660 الأواني البلاستيكية محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش 21-040 سم الكاشف ايثانول فيشر ساينس 04-355-451 الكاشف أدوات التشريح مرشحات 70 ميكرومتر بي دي فالكون هاتف: 352350 0.25٪ تربسين جيبكو 25200 الكاشف كيمويب VWR 82003-820