في المختبر نخاع عظم الفأر تمايز الخلايا اللحمية إلى الخلايا الشحمية

الملخص

المصدر: Maridas ، D. E. et al. ، عزل وثقافة وتمايز الخلايا اللحمية لنخاع العظام وأسلاف العظم من الفئران.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو تمايز الخلايا اللحمية لنخاع العظم (BMSCs) إلى خلايا شحمية. في العملية المكونة من خطوتين ، في وجود عوامل نمو وهرمونات محددة ، تتمايز BMSCs غير المتمايزة أولا إلى خلايا الدهون. تؤدي الخطوة الثانية التي تنطوي على العلاج بالجلوكوز والأنسولين إلى تكوين الخلايا الشحمية الناضجة مع قطرات دهنية متعددة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إعداد أنابيب التجميع

1. اصنع وسائط مزرعة BMSC عن طريق استكمال الحد الأدنى من α المتوسط الأساسي (MEM α) بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين.
2. ضع 100 ميكرولتر من وسائط استزراع BMSC في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. عادة ما تتناسب 3 عظام مع أنبوب واحد ، لذا استعد وفقا لذلك.
3. قم بقص أطراف الماصة سعة 200 ميكرولتر بما يكفي بحيث تتناسب مع أنابيب أجهزة الطرد المركزي. أدخل الأطراف داخل الأنابيب وتأكد من إغلاق الأغطية قبل وضع الأنابيب على الثلج.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن إدخال أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.75 مل مع قطع الأطراف في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.

< p class = "jove_title" >2. حصاد العظام من الفئران

1. قتل باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   ملاحظه: تأكد من استخدام من نفس الجنس ويفضل أن تكون من نفس العمر. نستخدم بشكل روتيني التي تتراوح أعمارها بين 7 و 8 أسابيع. نوصي بتجميع الخلايا من 3 على الأقل لكل مجموعة تجريبية للحصول على مجموعة خلايا تمثيلية وقابلة للتكاثر بشكل أفضل.
2. ضع الفأر القتل الرحيم على ظهره على لوح تشريح. استخدم الملقط لإنشاء خيمة من الجلد على البطن. قم بعمل شق صغير (حوالي 1 سم) باستخدام مقص تشريح معقم. قشر الجلد باتجاه الأطراف والقدمين من الجرح لكشف أسفل البطن والساقين.
   1. قطع أسفل مفصل الكاحل لإزالة القدم. قطع على طول القمة الحرقفية عند الورك لفصل رأس عظم الفخذ عن عظم الورك. بينما لا يزال الفأر على ظهره ، قم بعمل شق في منتصف عظم الورك لفصل العظمتين الحرقفيتين.
3. باستخدام مناديل مبللة خالية من النسالة ، قم بإزالة العضلات بعناية من عظم الفخذ والظنبوب وعظام الحرقفية.
   ملاحظه: إن قطع أكبر قدر ممكن من الأوتار والعضلات من العظام يجعل التنظيف أسرع وأسهل باستخدام المناديل الخالية من النسالة (على سبيل المثال ، مناديل كيم). توخي الحذر عند التلاعب بالعظام لأنها تميل إلى الانكسار بسهولة وقد تزداد هشاشتها مع بعض الأنماط الوراثية.
بمجرد تشريح
4. جميع العينات ، ضعها في PBS على الجليد وانتقل إلى غطاء مزرعة معقم لخطوات العزل المتبقية.
   ملاحظه: سيؤدي العمل بشكل معقم قدر الإمكان إلى تقليل احتمالية التلوث في الثقافات.
5. قم بعمل جروح صغيرة (حوالي 1 إلى 2 مم) في كل من الأطراف القريبة والبعيدة من العظام قبل وضعها في الأطراف المقطعة داخل أنابيب الطرد المركزي.
   ملاحظه: تأكد من قطع كمية كافية بحيث يمكن طرد النخاع ؛ ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب القطع كثيرا حيث تميل مجموعات الخلايا إلى الاختلاف بناء على القرب داخل مساحة النخاع.
6. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تأكد من شطف كل النخاع وحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب سعة 1.5 مل أثناء وجود العظام داخل الإدخالات (إما طرف ماصة 200 ميكرولتر أو أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.75 مل). بمجرد جمع كل النخاع ، قم بإزالة الإدخالات مع العظام من أنابيب التجميع.
   ملاحظه: إذا تم مسح كل النخاع ، فستظهر العظام بيضاء. ومع ذلك ، إذا بقي النخاع في عظام معينة ، فحاول قطع الأطراف مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي.

< p class = "jove_title" >3. تعليق الخلية

1. باستخدام إبرة 25 جم ، اسحب كريات الخلية لأعلى ولأسفل ببطء لتفتيت الكتل ودمج جميع العينات في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل. أضف 10 مل من وسائط استزراع BMSC لكل 500 ميكرولتر من العينات.
2. ضع مرشحا 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتمرير معلق الخلية عبر هذا المرشح لإزالة شظايا العظام المحتملة.

< p class = "jove_title" >4. طلاء واستزراع مجموعات مختلطة من خلايا نخاع العظام (إجمالي BMCs)

ملاحظة: يتم زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

1. احسب عدد الخلايا وقم بوضعها عند 1.0 × 10⁶ خلايا / سم² في وسط الاستزراع. اترك 72 ساعة من المزرعة المختلطة حتى تلتصق الخلايا.
   ملاحظه: نوصي بتخفيف معلق الخلية 20 ضعفا في وسط المزرعة وتخفيفه مرة أخرى باللون الأزرق قبل عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بالنسبة للفئران الذكور C57Bl6 / J البالغة من العمر 7 أسابيع ، فإننا ننتج بشكل روتيني عدد خلية يبلغ حوالي 50 × 10⁶ خلايا ولكن العمر والجنس والسلالة يمكن أن تؤثر بشكل كبير.
   ملاحظه: يجب أن تعلق مجموعة مختلطة من الخلايا في الجزء السفلي من بئر المزرعة.
2. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط جديدة. استمر في تغيير الوسائط كل يومين وتحقق من التقاء. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-100٪ ، تكون جاهزة للتمايز. < / > ملاحظه: نظرا لأن هذه الثقافة مختلطة مع كل من BMSCs و HSCs ، يمكن استخدامها مباشرة لتكوين الأرومة العظمية ، وتكوين الشحم وكذلك تكوين العظم.

< p class = "jove_title" >5. طلاء واستزراع السكان المنقسمين من BMSCs (BMSCs الملتصقة)

ملاحظة: يتم زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

1. ضع جميع الخلايا التي تم جمعها من عظم الفخذ والساق والعظام الحرقفية لفأر واحد في طبق استزراع مقاس 10 سم (55 سم² من منطقة الاستزراع).
   ملاحظه: عند تجميع 2-3 فئران C57BL / 6J ، نقوم عادة بوضع مجموعة نخاع العظام "الإجمالية" في قارورة 150 سم².
2. بعد 48 ساعة من الثقافة المختلطة ، قم بإزالة وسائط المزرعة (التي تحتوي على HSCs غير الملتصقة). إذا كان سيتم إجراء تجارب تكوين العظم ، فضع هذه المجموعة من الخلايا غير الملتصقة جانبا ، وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالشفط والتخلص من هذه الخلايا.
3. اغسل اللوحة / القارورة باستخدام PBS بعناية حتى لا تزعج الخلايا المرفقة.
4. قم بإزالة PBS ورفع الخلايا عن طريق إضافة 0.25٪ من التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق. في هذه المرحلة ، يمكن حساب BMSCs ، التي تم رفعها الآن ، (كما حدث سابقا في الخطوة 4.1) وطلاءها للتجارب المستقبلية.
5. احسب عدد الخلايا اللازمة للطلاء. جهاز الطرد المركزي الحجم المطلوب لتعليق الخلية عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: عادة ما يتم طلاء الخلايا بناء على تجارب نقطة النهاية. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم عزل البروتين / الحمض النووي الريبي ، فعادة ما يتم عزله بكثافة أعلى (~ 1.0-2.0 × 10⁶ خلايا / بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار).
6. قم بإزالة الوسائط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في حجم وسائط الاستزراع اللازمة للطلاء. قم بوضع الخلايا في وسط الاستزراع وفقا للتجارب واتركها تلتصق لبضعة أيام. عندما تصل BMSCs إلى التقاء ، تابع إجراء التمايز.

< p class = "jove_title" >6. تمايز BMSCs

1. الخلايا الشحمية
   1. اصنع وسائط أساسية للخلايا الشحمية عن طريق خلط 90 مل من نسبة الجلوكوز العالية من Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ، و 10 مل من مصل الأبقار الجنينية ، و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 100 ميكرولتر 20 ملي روزيغليتازون و 100 ميكرولتر من الأنسولين 2 مل. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين هذه الوسائط عند 4 درجات مئوية للأسبوع أثناء تجربة التمايز.
   2. اصنع وسائط تحريض الخلايا الشحمية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 62.5 ملي مولار 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) و 25 ميكرولتر من 1 ملي مولار ديكساميثازون إلى 25 مل من وسائط قاعدة الخلايا الشحمية.
   3. بمجرد أن تتلاقى ثقافات BMSCs (إما إجمالي BMCs من الخطوة 4.3 أو BMSCs الملتصقة من الخطوة 5.6) ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط تحريض الخلايا الشحمية. ضع في اعتبارك هذا اليوم 0 من التمايز.
   4. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط وتحديث المزرعة باستخدام وسائط تحريض الخلايا الشحمية.
   5. في اليوم 4 ، قم بالتبديل إلى وسائط قاعدة الخلايا الشحمية.
      ملاحظه: يمكن أن تبدأ قطرات الدهون في الظهور في وقت مبكر من اليوم 2 أو اليوم 4.
   6. في اليوم السابع ، لاحظ أن الخلايا قد تراكمت قطرات الدهون القصوى وتعرض نمطا ظاهريا مشابها للخلايا الشحمية الناضجة. لا تزرع بعد هذه النقطة ، فقد يؤدي ذلك إلى موت / انفصال الخلايا.

المواد