عزل الخلايا التائية القائم على التعويم باستخدام فرز الخلايا المنشط بالطفو

الملخص

المصدر: Snow، T.، et al. عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتمددها من عينات الخلايا أحادية النواة أحادية الدم المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو عزل الخلايا التائية عن خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالطفو الوظيفية (BACS). تتضمن تقنية العزل الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + T عن طريق تسمية الخلايا بالأجسام المضادة المضادة ل CD3 البيوتينيل وفصل الخلايا المرتبطة بالأجسام المضادة باستخدام الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالستربتافيدين.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا التائية بالفقاعات الدقيقة باستخدام الاختيار الإيجابي

ملاحظة: يوضح هذا البروتوكول تفاصيل نهج الاختيار الإيجابي CD3⁺ على نطاق صغير باستخدام SAMBs.

1. احتضان 3 × 10⁸ PBMCs التي تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 مل من المخزن المؤقت للفصل مع الجسم المضاد المضاد للبيوتينيل CD3 (OKT3) بتركيز 25 نانوغرام من الجسم المضاد لكل 1 مليون خلية (25 نانوغرام / م). تخلط برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2. أضف فقاعات الستربتافيدين الدقيقة (SAMBs) بنسبة 0.5 (كمية SAMB): 1 (كمية الخلية) وفقا لتركيز SAMB المبلغ عنه من قبل الشركة المصنعة.
3. امزج باستخدام محور دوار تجاري من طرف إلى طرف (EOE) عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا المختارة إيجابيا في الجزء العلوي من التعليق مع SAMBs. ستكون الخلايا المتبقية غير المحددة في حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. باستخدام ماصة زجاجية مقاس 9 بوصات، أدخل الطرف الموجود أسفل طبقة الخلية الفقاعية إلى قاع الأنبوب، واستنشق حبيبات الخلية والطبقة السفلية باستخدام ماصة إلكترونية، وانقلها إلى أنبوب جديد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات البيوتين المضاد للإنسان CD3 (OKT3) الجسم المضاد بيوليجند هاتف: 317320 ليوكوباك بيوآي تي HUMANLMX100-0001129 PBMCs البشرية العادية بيوآي تي هومانهال ب - 0002562 مجموعة Streptavidin Microbubble Kit (تتضمن المخزن المؤقت لفصل Akadeum) أكاديوم 11110-000