استزراع الخلايا التائية المنشطة من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة

الملخص

المصدر: Mølgaard, K., et al. المراقبة في الوقت الحقيقي لتنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتمايزة بالسيتوكين. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لتنشيط الخلايا التائية الأولية البشرية. يؤدي حضانة الخلايا التائية الساذجة بخرز مغناطيسي مغلف بالأجسام المضادة المضادة ل CD3 و CD28 ، متبوعا بعلاج الإنترلوكين 2 أو الإنترلوكين -15 ، إلى تنشيط الخلايا التائية الساذجة وتمايزها وتكاثرها في الخلايا التائية المستجيبة أو الذاكرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

فئة

1. زراعة الخلايا الليمفاوية التائية الأولية البشرية المنشطة

1. ذوبان الخلايا (اليوم 1)
   1. قم بالتسخين المسبق 10 مل من RPMI 1640 لكل عينة إلى حوالي 37 درجة مئوية.
   2. خذ العدد المطلوب من أمبولات الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي وقم بتخزينها مؤقتا على الثلج الجاف.
   3. أعد تعليق الخلايا المجمدة في 10 مل من RPMI 1640 الدافئ مسبقا.
   4. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند RT.
   5. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق التعليق في 10 مل من RPMI 1640 وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في 1.1.4.
   6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا عند 2 × 10⁶ خلايا لكل مل من مصل X-VIVO 15 متوسط + 5٪ مصل بشري (يشار إليه فيما يلي: وسط الخلايا التائية).
   7. لوحة 2 مل من الخلايا لكل بئر في صفيحة زراعة خلية 24 بئرا وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. تنشيط الخلايا (اليوم 0)
   1. اغسل حبات CD3 / CD28 عن طريق نقل 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل 1 مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 12.5 ميكرولتر من PBS لكل 12.5 ميكرولتر من الخرز.
      ملاحظه: من المهم دوامة قارورة الخرز قبل الاستخدام.
   2. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على مغناطيس مناسب لمدة 1 دقيقة.
   3. تخلص من المخزن المؤقت وأعد تعليق الخرزات في الحجم الأصلي لوسط الخلية التائية (12.5 ميكرولتر من وسط الخلية التائية لكل 12.5 ميكرولتر من الحجم الأصلي للخرز).
   4. أضف 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل مليون من الخلايا المقابلة لنسبة 1: 2 (الخرز: الخلايا).
   5. قسم الخلايا إلى حالتين مع حوالي 5 ملايين خلية في كل منهما.
   6. أضف الحجم الصحيح للسيتوكينات إلى الظروف كما هو مذكور في الجدول 1.
   7. احتضان الخلايا لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. استزراع الخلايا (اليومان 3 و 5)
   1. أعد تعليق الخلايا وقسمها عن طريق نقل نصف الحجم من كل بئر إلى بئر جديد. أضف نفس الحجم من وسط الخلية التائية الطازجة إلى كل بئر.
   2. أضف سيتوكينات جديدة إلى كل حالة كما هو مذكور في الجدول 1.

السيتوكين رصيد عامل التخفيف نهائي الشرط 1 IL-2 3 × 10⁶ وحدة / مل 30,000 100 وحدة / مل الشرط 2 IL-15 2 × 10⁵ وحدة / مل 2,000 100 وحدة / مل < p class = "jove_content" >الجدول 1: تحضير مزارع السيتوكين المستخدمة لتوجيه التغيرات الأيضية في الخلايا التائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا نونك 142485 الخرز المضاد ل CD3xCD28 جيبكو 11161 د إكس فيفو 15 لونزا BE02-060F مصل بشري سيجما ألدريتش H4522 الحرارة غير نشطة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة IL-15 بيبروتك 200-02 IL-2 بيبروتك 200-15 ليمفاوريب تقنيات الخلايا الجذعية 7801 ريال برنامج تلفزيوني ثيرمو فيشر 10010023 RPMI 1640 جيبكو ثيرمو فيشر 61870036 خرز الخلية التائية المغناطيس DynaMag-2 Magnet ثيرمو فيشر 12321 د