تحديد المجموعات الفرعية للخلايا التائية التنظيمية من الغدد الليمفاوية لتصريف البنكرياس في الفئران

الملخص

المصدر: Luo, Z., et al. تحديد المجموعات الفرعية للخلايا التائية التنظيمية في الغدة الصعترية الفئرانية والعقدة الليمفاوية لتصريف البنكرياس والطحال باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp.(2019)

< p class = "jove_content" >في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لعزل الخلايا المفردة عن الغدد الليمفاوية لتصريف البنكرياس الفئران (PDLNs) وتوصيف الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) من مجموعة الخلية المفردة باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم تحديد Tregs بناء على التعبير الإيجابي لعلامات سطح الخلية CD4 و CD25 و Nrp1 ، جنبا إلى جنب مع عوامل النسخ النووي Foxp3 و Helios.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. عزل الخلية الواحدة من PDLN

1. ضع شبكة معدنية معقمة 250 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 15 مل في رف. اشطف الشبكة ب 1 مل من RPMI.
2. انقل الغدد الليمفاوية إلى الشبكة المعدنية وطحنها من خلال الشبكة باستخدام زوج من الملقط. ضع 1 مل من RPMI على الشبكة المعدنية لطرد الخلايا في الأنبوب. كرر 3 مرات أخرى وقم بإزالة الشبكة.
3. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. أعد تعليق حبيبات الخلية في حوالي 5 مل من RPMI. املأ الأنابيب ب RPMI.
5. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في حوالي 5 مل من RPMI. املأ الأنابيب ب RPMI.
7. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من RPMI. انقل 2 مل من تعليق الخلية إلى 5 مل من الأنابيب السفلية المستديرة مع أغطية مصفاة الخلية. ضع معلق الخلية على أغطية مصفاة الخلية.

< p class = "jove_title" >2. قياس التدفق الخلوي

1. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من PDLNs عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة السطحية التالية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي (FACS buffer): 0.75 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من الجسم المضاد CD4 المترافق FITC ، 0.60 ميكروغرام / 100 ميكرولتر الجسم المضاد CD8 المترافق APC-H7 ، 0.30 ميكروغرام / 100 ميكرولتر الجسم المضاد CD25 المترافق PE ، 5 ميكرولتر (1: 20) الجسم المضاد Nrp1 المترافق APC. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة.
3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر مرة أخرى.
4. قم بإصلاح الخلايا ونفاذها عن طريق إعادة تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتثبيت النفاذية (PFB).
   ملاحظه: يتم تحضير PFB عن طريق خلط جزء واحد من تركيز التثبيت / النفاذية مع 3 أجزاء من تخفيف التثبيت / النفاذية.
5. احتفظ بالأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   ملاحظه: حضانة 1 ساعة تعمل أيضا.
6. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من عازلة غسيل النفاذية (PWB). قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية
   ملاحظه: يتم تحضير PWB عن طريق تخفيف عازلة النفاذية (10x) إلى 1:10 في الماء المقطر.
8. تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة داخل الخلايا التالية في 100 ميكرولتر من PWB: 0.30 ميكروغرام / 100 ميكرولتر الجسم المضاد Foxp3 المترافق PE-Cy7 ، 4 ميكرولتر (1: 25) جسم مضاد هيليوس مترافق من المحيط الهادئ. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة.
9. أضف 500 ميكرولتر من PWB إلى كل أنبوب. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من PWB. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
11. أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
12. تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي.
13. قم ببوابة الخلايا المفردة استنادا إلى منطقة التشتت الجانبية والارتفاع والعرض ومنطقة التشتت الأمامية والارتفاع والعرض. قم بتشغيل مليون حدث للتحليل.
14. تصدير ملفات FCS للتجارب وتحليلها باستخدام برنامج محلل قياس التدفق الخلوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI-1640 سيجما ألدريتش R0883-500 مل eBioscience Foxp3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخ ثيرموفيشر 00-5523-00 يحتوي على تركيز التثبيت / النفاذية ، التثبيت / النفاذية المخفف ومخزن النفاذية (10x) eBioscience التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت ثيرموفيشر 00-4222-26 CD4 الجسم المضاد أحادي النسيلة (RM4-5) ، FITC ، eBioscience ثيرموفيشر 11-0042-85 CD25 الجسم المضاد أحادي النسيلة (PC61.5) ، PE ، eBioscience ثيرموفيشر 12-0251-83 BD Pharmingen APC-H7 الفئران المضادة للفأر CD8a BD Biosciences 560182 الفأر Neuropilin-1 الجسم المضاد المترافق APC أنظمة البحث والتطوير FAB5994A الجسم المضاد أحادي النسيلة FOXP3 (FJK-16s) ، PE-Cyanine7 ، eBioscience ثيرموفيشر 25-5773-82 المحيط الهادئ الأزرق المضاد للفأر / الجسم المضاد هيليوس البشري بيو ليجند هاتف: 137220 فالكون 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع ، مع غطاء مصفاة الخلية كورنينج 352235 تم دمج شبكة نايلون 35 ميكرومتر في الغطاء المفاجئ ثنائي الموضع أنبوب 15 مل ، 120 مم × 17 مم ، PP سارستيدت 62.554.002 قياس التدفق الخلوي دينار بحريني برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي إنيفاي تكنولوجيز فلولوجيك