مقالة منهجية

طريقة في المختبر لتمايز الخلايا الضخمة وتكوين الصفائح الدموية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Perdomo, J., et al. تمايز الخلايا الضخمة وتكوين الصفائح الدموية من خلايا CD34 + المشتقة من دم الحبل السري البشري. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتمايز الخلايا الضخمة وتكوين الصفائح الدموية. تتمايز الخلايا الجذعية السلفية المكونة للدم - المعزولة من دم الحبل السري البشري - إلى خلايا ضخمة ناضجة في وجود الثرومبوبويتين. تنتج الخلايا الضخمة الناضجة امتدادات سيتوبلازمية تسمى البروبلايت ، والتي تؤدي إلى ظهور الصفائح الدموية الفردية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

فئة

1. تمايز الخلايا الضخمة

  1. البذور 5 × 105 خلايا / مل CD34 + في 2 مل من SFM مكملة ب 50 نانوغرام / مل من الثرومبوبويتين البشري المؤتلف (rhTPO) لكل بئر في طبق 12 بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في جو مرطب إذا كانت الخلايا ملتقية قبل أن تكون مطلوبة للتحليل ، فقم بحصاد الخلايا وتقسيمها إلى آبار متعددة بوسائط جديدة و rhTPO.
    ملاحظه: يجب إعداد بئرين أو ثلاثة على وجه التحديد لمراقبة التمايز في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال ، الأيام 7 و 9 و 10).
  2. حصاد الخلايا من الآبار المخصصة لمراقبة التمايز دون إزعاج الخلايا في الآبار الأخرى.
  3. الخلايا الملطخة التي تحتوي على 20 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل GPIIb / CD41-FITC و 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل GPIX / CD42a-Alexa Fluor 647 في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. قم بإعداد أنبوب تحكم باستخدام الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل المعنية. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. أضف 1 مل من SB للغسل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200-300 ميكرولتر من SB. تحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  5. لكل فلوروفور ، قم بتحليل عناصر التحكم في النمط المتماثل لتعيين البوابة لمجموعات FITC و Alexa Flour 647 الإيجابية. قم بتحليل عينات الخلايا الملطخة لتحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة المزدوجة CD41 + / CD42a + ، والتي تمثل MK الناضجة (الشكل 1 ج).
  6. للتصور المجهري لعلامات سطح الخلية ، قم بتلطيخ الخلايا كما هو موضح في 1.3.
    1. أضف 1 مل من SB للغسل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من SB وقم بتدويرها على شريحة زجاجية عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإصلاح الخلايا على الشريحة عن طريق غمسها في الميثانول لمدة 30 ثانية. جفف في الهواء ، أضف 20 ميكرولتر من وسائط التثبيت التي تحتوي على DAPI (انظر جدول المواد) ، وقم بتغطيتها بغطاء ، وتصورها باستخدام مجهر الفلورسنت (الشكل 2 أ).
  7. لتصور المستضدات داخل الخلايا ، قم بتعليق الخلايا في PBS وثبتها باستخدام بارافورمالدهيد (تركيز نهائي 1٪) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لاختراق الخلايا ، أضف triton-X 100 (0.1٪) واحتضن لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا ب 2 مل PBS / 0.1٪ تريتون-X 100. أعد التعليق في 100 ميكرولتر من PBS / 0.1٪ triton-X 100 ، وأضف الأجسام المضادة المضادة ل vWf ومضادة ل CD62p (تخفيف 1: 200) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. اغسل ب 2 مل PBS / 0.1٪ triton-X 100 وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق ، وأعد تعليقه في 100 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت ، وأضف IgG-Alexa 594 المضاد للماوس ومضاد للأرانب IgG-Alexa 488 (1: 100). احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسلها ب 2 مل PBS / 0.1٪ triton-X 100 ، وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت ، وأضف 20 ميكرولتر من مضاد CD42b-APC. ثم قم بتدوير الخلايا على شرائح زجاجية كما هو موضح في الخطوة 1.6.1 وقم بإعداد عينات للتصور المجهري كما هو موضح في الخطوة 1.6.1.
  8. لتحديد ploidy ، حصاد الخلايا في الأيام 12 أو 13 من التمايز. أضف 1 مل من SB للغسل. جهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق وصمة عار بجسم مضاد 20 ميكرولتر مضاد ل GPIIb / CD41-FITC في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
    1. اغسل مرة واحدة ب 1 مل من SB وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسترات ناقص التوتر (1.25 ملي سترات الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 3.5 ملي سكر العنب) الذي يحتوي على 20 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم و 0.05٪ تريتون-X 100. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    2. أضف RNase إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محميا من الضوء. حدد شدة يوديد البروبيديوم عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق جمع 30,000 إلى 50,000 حدث من سكان CD41-FITC + (الشكل 2 ج).
< p class = "jove_title" >2. عد الصفائح الدموية ، تعداد الصفائح الدموية ، وتنشيط الصفائح الدموية

  1. حصاد الخلايا (من الخطوة 1.1) في الأيام 8 أو 9 من التمايز والبذور عند 1 × 104 خلايا / بئر في ألواح 48 بئرا في 200 ميكرولتر من SFM الطازج المكمل ب 50 نانوغرام / مل rhTPO. استزراع لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظه: لأغراض القياس الكمي ، آبار البذور في ثلاث نسخ. هذه الكثافة المنخفضة مطلوبة لتصور وعد MK الحاملة للصفيحات. عادة ما تبدأ الصفيحات في الظهور بعد يومين من الثقافة. الذروة بين الأيام 4 و 5.
  2. احسب عدد MK الحامل للصفيحات في البئر بأكمله على مجهر ضوئي مقلوب باستخدام أهداف 10X أو 20X.
    ملاحظه: يفضل استخدام مرحلة المجهر الساخن (37 درجة مئوية) لأن الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة يؤدي إلى انكماش امتدادات الصفيحات. لوحظت الصفيحات الدموية على أنها امتدادات طويلة من جسم MK. قد يكون لكل عضو الكنيست العديد من نتوءات الصفائح الدموية. مع تطور الصفيحات الدموية ، يتناقص حجم جسم عضو الكنيست.
  3. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تلطخ الخلايا التي تحتوي على 20 ميكرولتر من الجسم المضاد CD41-FITC المضاد للإنسان ، كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. احسب النسبة المئوية ل MK الحامل للصفيحات (pbMK):
    pbMK (٪) = [(MKs الحاملة للصفيحات / البئر) / (إجمالي خلايا CD41 + / البئر)] × 100
  4. لحساب الصفائح الدموية المنبعثة في وسط الاستزراع، امزج الخلايا برفق باستخدام ماصة باستور واجمع 100 ميكرولتر في 14 أو 15 يوما من المزرعة.
    1. وصمة عار بجسم مضاد CD41-FITC مضاد للإنسان 20 ميكرولتر لمدة 20 - 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد أنبوب تحكم باستخدام الجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل المعني.
    2. أضف 150 ميكرولتر من SB و 50 ميكرولتر من حبات العد.
    3. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بتعيين FSC و SSC على مقياس السجل. استخدم الصفائح الدموية الطبيعية للدم البشري من البلازما الغنية بالصفائح الدموية الملطخة ب CD41-FITC كما هو موضح في القسم 2.4.1 لضبط بوابة الصفائح الدموية (الشكل 3 أ).
    4. تحليل الصفائح الدموية الملطخة عن طريق عد الخرزات عن طريق قياس التدفق الخلوي. اجمع 1,000 حدث من عد الخرز باستخدام مخطط مبعثر FSC مقابل SSC (الشكل 3 أ). احسب عدد الصفائح الدموية بناء على الأحداث الإيجابية CD41-FITC (الشكل 3 ب) باستخدام الصيغة:
      الصفائح الدموية لكل ميكرولتر = [(عدد الأحداث الإيجابية CD41-FITC) / 1,000 خرزة)] × [(عدد الخرزات في 50 ميكرولتر) / حجم العينة)]
  5. لتحليل تنشيط الصفائح الدموية ، امزج الخلايا برفق باستخدام ماصة باستور واجمع 100 ميكرولتر في 14 أو 15 يوما من الزراعة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتيرود (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الرأس ، 1 ملي مللي كلوريد2 ، 1.8 ملي كلوريد الكالسيوم2 ، 0.2 ملي Na2HPO4 ، 12 ملي NaHCO3 ، 5.5 ملي مولار D-glucose ، درجة الحموضة 6.5) وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لخلايا الحبيبات.
    1. اجمع المادة الطافية وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق لجزيئات بيليه بحجم الصفائح الدموية.
    2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتيرود. أضف 20 ميكرولتر من الجسم المضاد PAC1-FITC وثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP) إلى التركيز النهائي البالغ 20 ميكرومتر. التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للأحداث الإيجابية ل FITC. استخدم الصفائح الدموية البشرية الطازجة المعالجة بنفس طريقة التحكم الإيجابي (الشكل 3 ج).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مخططات قياس التدفق الخلوي لعزل خلايا CD34 + وتمايز MK في الثقافة. (أ) تم تلطيخ الخلايا أحادية النواة (المسورة كما هو موضح في اللوحة اليسرى) المنقاة من دم الحبل السري البشري بجسم مضاد مضاد ل CD34-PE لتحديد النسبة المئوية لخلايا CD34 + في العينة (1.3٪ ، اللوحة اليمنى). (ب) بعد الانفصال ، تم تلطيخ الجزء الموجب بالأجسام المضادة ل CD34-PE وم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كواشف زراعة الخلايا TPO البشري المؤتلف ميلتيني بيوتيك 130-094-013 StemSpan SFEM II تقنيات الخلايا الجذعية 9605 وسائط خالية من المصل لخلايا CD34+ قياس التدفق الخلوي وكواشف تلطيخ الخلايا PE ماوس مضاد للإنسان CD34 BD Biosciences 340669 استنساخ 8G12. يمكن استخدام هذا لفحص نقاء CD34. تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف. ماوس PerCP مضاد للإنسان CD45 BD Biosciences 347464 1:10 التخفيف التحكم في النمط المتماثل PerCP BD Biosciences 349044 1:10 التخفيف FITC ماوس مضاد للإنسان CD41a BD Biosciences 340929 تركيز الأجسام المضادة النهائي 1: 5 التخفيف. APC ماوس مضاد للإنسان CD42b BD Biosciences 551061 يمكن أيضا استخدام هذا الجسم المضاد للكشف عن MK الناضج (النسبة المئوية للخلايا الموجبة عادة ما تكون أقل من النسبة المئوية للخلايا المضادة ل CD42a). تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف. أليكسا فلور 647 ماوس مضاد للإنسان CD42a عبد العالي سيروتيك MCA1227A647T يتم توزيعه حاليا بواسطة Bio-Rad. تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف. Alexa Fluor 647 التحكم السلبي في الماوس عبد العالي سيروتيك MCA928A647 يتم توزيعه حاليا بواسطة Bio-Rad. الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشابه مكافحة فون ويلبراند عامل الأرنب متعدد النسيلة أبكام أ 6994 1: 200 تخفيف V450 ماوس مضاد للهمنة CD41a BD Biosciences 58425 1: 20 تخفيف التحكم في النمط المتماثل V450 BD Biosciences 580373 1:20 التخفيف الجسم المضاد PAC1-FITC BD Biosciences 340507 1:10 التخفيف مكافحة CD62p الماوس أحادي النسيلة أبكام أ ب6632 1: 200 تخفيف Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgG إنفيتروجين أ 11008 1: 100 التخفيف Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للفأر IgG إنفيتروجين أ 11020 1: 100 التخفيف كوكتيل التحكم في النمط المتماثل Ig-C BD Biosciences 558659 الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشابه يوديد البروبيديوم سيجما ألدريتش ص 4864 CountBright الخرز العد المطلق المجسات الجزيئية ، Invitrogen سي 36950 عد الخرز المواد Falcon 5 مل أنابيب البولي بروبيلين FACS ذات القاع المستدير ، مع غطاء كبس ، معقم تقنيات في المختبر 352063 شرائح زجاجية مينزل جلاسر J3800AMNZ تركيب الوسائط باستخدام DAPI مختبرات ناقلات إتش-1200 وسيط تركيب مضاد للبهتان مع DAPI معدات مجهر مقلوب لايكا مجهر مقلوب DMIRB مجهر الفلورسنت زييس Vert.A1 محلل الخلايا BD Biosciences FACS كانتو II جهاز الطرد المركزي Cytospin العلم الحراري سيتوسبين 4 برمجيات برنامج محلل الخلايا BD Biosciences برنامج FACS Diva برنامج تحليل الخلية الواحدة نجمة الشجرة فلولجو برنامج المجهر الفلوري زييس زين 2 الإصدار الأزرق

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD41 CD42a PAC 1

مقالات ذات صلة