مقالة منهجية

نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد لتوليد مهاجرين الغدة الصعترية المشتقين من iPSC

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Vizcardo, R., et al. نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد لتوليد مهاجرين صعتريين مشتقين من الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية الناجم عن الفئران. J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتوليد خلايا تائية وظيفية خاصة بالمستضد من الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC باستخدام نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد. أدى الزراعة المشتركة للخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC مع الفئران الداخلية المستنفدة من الخلايا الليمفاوية الفصوص الصعترية الجنينية إلى النضج الناجح للخلايا التائية لتشكيل CD8αβ + معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى + iPSC المهاجرين الصعتريين المشتقة من (iTEs).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. 3D ثقافة الأعضاء الصعترية لتوليد iTE

  1. حصاد فصوص الغدة الصعترية للجنين في الفئران ونشر الخلايا الليمفاوية الذاتية عن طريق علاج ديوكسي جوانوزين (dGUO).
  2. في اليوم السابع من علاج dGUO ، خذ أربعة أطباق جديدة مقاس 10 سم واملأ كل منها ب 20 مل من الوسائط الكاملة (معهد روزويل بارك التذكاري Media 1640 [RPMI 1640] + 10٪ FBS + 1x L-alanyl-L-glutamine + 1x بيروفات الصوديوم + 1x الحد الأدنى من الوسط الأساسي مع الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM-NEAA) + 1x البنسلين والستربتومايسين + [1: 1000] 2-mercapto ethanol).
  3. انقل جميع أغشية النيتروسليلوز مع فصوص الغدة الصعترية إلى طبق واحد مقاس 10 سم. افصل الفصوص الفردية عن الغشاء بالملقط ، مما يسمح بغمرها في الوسائط. تجاهل الأغشية. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
  4. انقل فصوص الغدة الصعترية إلى طبق جديد مقاس 10 سم بوسائط كاملة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  5. باستخدام الملقط ، قم بتثبيت الفصوص الصعترية في الطبق (واحدا تلو الآخر) ، وباليد الأخرى قم بعمل شق بعمق 100-200 ميكرومتر في الوسط وقم بتمديد نصف قطر الفص لتسهيل هجرة سلف الخلايا التائية إلى الفص.
  6. انقل الفصوص الصعترية إلى طبق جديد مقاس 10 سم مليء بوسائط التمايز الكاملة (وسائط كاملة + 5 نانوغرام / مل إنترلوكين فأر -7 (IL-7) + 5 نانوغرام / مل من فأر Flt3 ligand (FLT3L) + 5 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية (SCF)).
  7. اختياريا ، إذا كنت تستخدم لوحات ثقافة ثلاثية الأبعاد مع شبكات المستوى السفلي والعلوي ، فاملأ كلتا الشبكتين ب PBS معقم لمنع تبخر وتجفيف القطرات المعلقة.
  8. انقل 30 ميكرولتر من الوسائط الكاملة التي تحتوي على فص صعتري معالج ب dGuo من الخطوة 1.6 إلى كل بئر من لوحة الثقافة ثلاثية الأبعاد.
  9. اجمع خلايا سلالة T غير الملتصقة (الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC) من الزراعة المشتركة OP9 / DLL1 (الأيام 16-21) وأعد تعليقها عند 2-5 × 103 خلايا سلالة لكل 20 ميكرولتر من الوسائط.
  10. أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية إلى كل فص صعترية في لوحة الثقافة ثلاثية الأبعاد. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  11. اضبط الماصة P200 على 30 ميكرولتر وشفط الوسائط بعد سحب العينة عدة مرات من كل بئر لإزالة جميع الخلايا المحيطة بالفصوص الصعترية. تجاهل الوسائط وأضف 30 ميكرولتر من الوسائط الكاملة. كرر هذا الإجراء 5-7 مرات لإزالة أي خلايا تائية إضافية غير ناضجة لا تهاجر إلى الفصوص. قم بتغيير 25-30 ميكرولتر من الوسائط يوميا بعد ذلك.
  12. تأكيد تكوين هالة من المهاجرين الصعترية المشتقين من iPSC (iTE) حول الفصوص بدءا من الأيام 4-5 عن طريق المجهر الضوئي.
  13. اجمع iTE يوميا عن طريق سحب الوسائط دون انقطاع الفصوص. قم بتغيير الوسائط كل يوم واستمر في التجميع لمدة تصل إلى 12 يوما تقريبا.
  14. iTE المحصودة جاهزة للاستخدام في التحليلات الجزيئية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 والشكل 4) أو تجارب الزرع في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: الكيمياء المناعية للفصوص الصعترية المصنفة بالخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC. أعلى: تلطيخ H&E للفص الصعتري مع وبدون بذر الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC. من الثانية من أعلى إلى أسفل: صور متحدة البؤر للفصوص المقطعة الملطخة ب DAPI (النواة) ، CD3 (الخلية التائية) ، والاندماج. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر.

< p class = "jove_content" fo:...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-ديوكسيجوانوزين سيجما ألدريتش هاتف: 312693-72-4 2-ميركابتو إيثانول (1،000x) ثيرمو فيشر العلمي 21985-023 FBS الجوزاء 100-500 Flt-3 ligand أنظمة البحث والتطوير 427-فلوريدا إنترلوكين -7 أنظمة البحث والتطوير 407 مل محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM جيبكو 11140050 مسحوق MEM جيبكو 61100061 بيروفات الصوديوم ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 11360-070 عامل الخلايا الجذعية (SCF) أنظمة البحث والتطوير 455-MC البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140-122 الرقم الهيدروجيني الملحي المخزن بالفوسفات 7.4 (1x) ثيرمو فيشر العلمي 10010-023 RPMI 1640 جيبكو 11875093 طبق 10 سم شركة كورنينج 353003 Perfecta3D لوحة إسقاط معلقة سيجما ألدريتش HDP1096 ملقط دومونت 0108-5 ب OP9 / N-DLL1 مركز الموارد الحيوية Riken القط # RCB2927 ؛ RRID:CVCL_B220 جلوتا ماكس (100x) ثيرمو فيشر العلمي 35050-061

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

dGUO CD8

مقالات ذات صلة