$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. توسع الخلايا القاتلة الطبيعية من أنسجة الكبد (اليوم 0) ، كما هو موضح في الشكل 1.
ملاحظة: يرتبط عدد الخلية الأولي وقابلية البقاء ارتباطا وثيقا بالوقت الذي انقضى منذ إزالة الأعضاء وكمية عينة الأنسجة الأولية. ومع ذلك ، إذا تم وضع الأنسجة في 30 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) وحفظها على الثلج أو في الثلاجة عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، فلا يزال من الممكن توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية بدرجة نقاء عالية وقابلية للحياة حتى 24 ساعة بعد ذلك.
- تحديد مناطق الأنسجة القابلة للحياة للحصول على الخلايا الليمفاوية من الأنسجة والأقسام باستخدام معدات جراحية معقمة.
- ضع المناديل في 30 مل من HBSS (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم) واحتفظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للتحضير للعزل.
- افرم المنديل إلى مكعبات بحجم <0.5 سم باستخدام شفرات حلاقة معقمة أو مقص وملقط داخل خزانة السلامة الحيوية.
- تحضير محلول الكولاجيناز الوريدي 1x (1 مجم / مل) عن طريق تخفيف مخزون 10x في HBSS (10x كولاجيناز IV: 10 مجم / مل أو ~ 200 وحدة / مل).
- ضع قطع الأنسجة المفرومة في أنابيب فصل الأنسجة. املأ الأنابيب بما لا يزيد عن 4 جم من الأنسجة واغمر قطع المناديل في ~ 10 مل من 1x كولاجيناز IV. < / >
ملاحظه: لا ينصح باستخدام DNase I لأنه قد يقلل بشكل طفيف من قابلية NK للبقاء والعائد. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمعرفة أنابيب فصل الأنسجة المحددة المستخدمة.
- ضع أنابيب فصل الأنسجة في جهاز فصل الأنسجة وامزجها عند 37 درجة مئوية لفرم الأنسجة جيدا. < / >
ملاحظه: بالنسبة لأنسجة الكبد، قد يستغرق ذلك أكثر من 30 دقيقة. لمزيد من الأنسجة القابلة للتفتيت ، قد يكون حوالي 15 دقيقة كافيا. يرجى الرجوع إلى جدول المواد للحصول على أنابيب معينة لفصل الأنسجة ومفكك الأنسجة المستخدم.
- قم بإزالة أنابيب فصل الأنسجة وقم بترتيتورها من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرومتر باستخدام الواجهة الخلفية لحقنة سعة 5 مل. اجمع المواد الملوءة وتخلص من الأجزاء الكبيرة غير المهضومة.
- قم بتدوير المادة المزيعة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية.
- أعد تعليق كريات الخلية في 30٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP) السيليكا المغلفة لإزالة الخلايا الدهنية التي من شأنها أن تلوث الجزء النهائي من الخلايا الليمفاوية.
- لتحضير 1x السيليكا المطلية ب PVP ، استخدم تخفيف 9: 1 من السيليكا المطلية ب PVP في 10x PBS. < / >
ملاحظه: راجع جدول المواد للسيليكا المطلية ب PVP المحددة المستخدمة.
- لتحضير 30٪ من السيليكا المطلية ب PVP ، قم بتخفيف 1x السيليكا المطلية ب PVP باستخدام PBS / HBSS.
- قم بتدوير حبيبات الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 9 مل من وسائط R-10.
ملاحظه: راجع جدول المواد لتكوين وسائط R-10.
- ضع طبقة بعناية من معلق الخلية على 4 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية أو Ficoll لفصل الخلايا الليمفاوية لفصل الخلايا الليمفاوية عن خلايا الدم الحمراء والخلايا النووية متعددة الأشكال.
- افصل الطبقات عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل التسارع والفرامل أو عند أدنى إعداد. صب الطبقة العلوية المتوسطة بعناية وحصاد الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا الليمفاوية المتسللة للأنسجة.
- اشطف الخلايا ب 10 مل من الوسائط وانتقل إلى عد الخلايا ، وقياس التدفق الخلوي ، ونقل الخلايا ، وتجميد الخلايا ، أو بروتوكول توسيع NK الأساسي.
