توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Ma, M., et al. القاتل الطبيعي (NK) وطريقة توسيع الخلايا CAR-NK باستخدام خط الخلايا البائية المعدلة بغشاء IL-21. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) مباشرة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام خط الخلايا المغذية. يتم استزراع PBMCs بشكل مشترك مع الخلايا المغذية للأرومات الليمفاوية المعدلة وراثيا التي تعبر عن إنترلوكين -21 المرتبط بالغشاء (mIL-21) ، ويتم استكمال الثقافة بالسيتوكينات إنترلوكين -2 (IL-2) وإنترلوكين -15 (IL-15). معا ، يؤدي هذا المزيج من الروابط إلى التوسع المطول لخلايا NK ذات النقاء العالي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. توسع الخلايا القاتلة الطبيعية من أنسجة الكبد (اليوم 0) ، كما هو موضح في الشكل 1.

ملاحظة: يرتبط عدد الخلية الأولي وقابلية البقاء ارتباطا وثيقا بالوقت الذي انقضى منذ إزالة الأعضاء وكمية عينة الأنسجة الأولية. ومع ذلك ، إذا تم وضع الأنسجة في 30 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) وحفظها على الثلج أو في الثلاجة عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، فلا يزال من الممكن توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية بدرجة نقاء عالية وقابلية للحياة حتى 24 ساعة بعد ذلك.

1. تحديد مناطق الأنسجة القابلة للحياة للحصول على الخلايا الليمفاوية من الأنسجة والأقسام باستخدام معدات جراحية معقمة.
2. ضع المناديل في 30 مل من HBSS (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم) واحتفظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للتحضير للعزل.
3. افرم المنديل إلى مكعبات بحجم <0.5 سم باستخدام شفرات حلاقة معقمة أو مقص وملقط داخل خزانة السلامة الحيوية.
4. تحضير محلول الكولاجيناز الوريدي 1x (1 مجم / مل) عن طريق تخفيف مخزون 10x في HBSS (10x كولاجيناز IV: 10 مجم / مل أو ~ 200 وحدة / مل).
5. ضع قطع الأنسجة المفرومة في أنابيب فصل الأنسجة. املأ الأنابيب بما لا يزيد عن 4 جم من الأنسجة واغمر قطع المناديل في ~ 10 مل من 1x كولاجيناز IV.
   ملاحظه: لا ينصح باستخدام DNase I لأنه قد يقلل بشكل طفيف من قابلية NK للبقاء والعائد. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمعرفة أنابيب فصل الأنسجة المحددة المستخدمة.
6. ضع أنابيب فصل الأنسجة في جهاز فصل الأنسجة وامزجها عند 37 درجة مئوية لفرم الأنسجة جيدا.
   ملاحظه: بالنسبة لأنسجة الكبد، قد يستغرق ذلك أكثر من 30 دقيقة. لمزيد من الأنسجة القابلة للتفتيت ، قد يكون حوالي 15 دقيقة كافيا. يرجى الرجوع إلى جدول المواد للحصول على أنابيب معينة لفصل الأنسجة ومفكك الأنسجة المستخدم.
7. قم بإزالة أنابيب فصل الأنسجة وقم بترتيتورها من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرومتر باستخدام الواجهة الخلفية لحقنة سعة 5 مل. اجمع المواد الملوءة وتخلص من الأجزاء الكبيرة غير المهضومة.
8. قم بتدوير المادة المزيعة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية.
9. أعد تعليق كريات الخلية في 30٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP) السيليكا المغلفة لإزالة الخلايا الدهنية التي من شأنها أن تلوث الجزء النهائي من الخلايا الليمفاوية.
   1. لتحضير 1x السيليكا المطلية ب PVP ، استخدم تخفيف 9: 1 من السيليكا المطلية ب PVP في 10x PBS.
      ملاحظه: راجع جدول المواد للسيليكا المطلية ب PVP المحددة المستخدمة.
   2. لتحضير 30٪ من السيليكا المطلية ب PVP ، قم بتخفيف 1x السيليكا المطلية ب PVP باستخدام PBS / HBSS.
10. قم بتدوير حبيبات الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية.
11. أعد تعليق حبيبات الخلية في 9 مل من وسائط R-10.
    ملاحظه: راجع جدول المواد لتكوين وسائط R-10
12. ضع طبقة بعناية من معلق الخلية على 4 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية أو Ficoll لفصل الخلايا الليمفاوية لفصل الخلايا الليمفاوية عن خلايا الدم الحمراء والخلايا النووية متعددة الأشكال.
13. افصل الطبقات عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل التسارع والفرامل أو عند أدنى إعداد. صب الطبقة العلوية المتوسطة بعناية وحصاد الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا الليمفاوية المتسللة للأنسجة.
14. اشطف الخلايا ب 10 مل من الوسائط وانتقل إلى عد الخلايا ، وقياس التدفق الخلوي ، ونقل الخلايا ، وتجميد الخلايا ، أو بروتوكول توسيع NK الأساسي.

< p class = "jove_title" >2. تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية من PBMCs (أو CB أو أنسجة الأعضاء) (اليوم 0) ، كما هو موضح في الشكل 2.

1. قم بإذابة PBMC المجمدة والخلايا المغذية المجمدة والمشععة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. اغسل PBMC و 100 خلية مشعة بجاما (مشعة بالشعيع Gy) 221 مللي من 21 عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام 10 مل من وسائط R-10 بشكل منفصل.
3. حفظ 1 × 10⁶ خلايا من PBMC لقياس التدفق الخلوي.
   ملاحظه: يعد نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية الأولي عاملا مهما في حساب معدل تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية.
4. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط R-10. عد الخلايا باستخدام Trypan Blue.
5. امزج 5 × 10⁶ خلايا من PBMC مع 10 × 10⁶ خلايا من 100 خلية 221 مللي مللي 21 مشعة بالإشعاع في صفيحة خاصة من 6 آبار (انظر جدول المواد).
6. أضف 30 مل من وسائط R-10 مكملة ب IL-2 البشري (200 وحدة / مل) و IL-15 البشري (5 نانوغرام / مل) (انظر جدول المواد).
7. احتضان اللوحة الخاصة المكونة من 6 آبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
8. استبدل الوسائط بوسائط R-10 مكملة ب IL-2 البشري (200 وحدة / مل) و IL-15 البشري (5 نانوغرام / مل) للحفاظ على الخلايا القاتلة الطبيعية كل 3-4 أيام.
   ملاحظه: حافظ على أقل من 20 × 10⁶ خلايا لكل بئر لمزيد من التوسع عند كل تغيير للوسائط. للحصول على أفضل قابلية للحياة ، تأكد من أن إجمالي عدد الخلايا في كل بئر لا يتجاوز 100 × 10⁶ خلايا.
9. سجل العدد الإجمالي للخلية وقابليتها للحياة وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي كل 3-4 أيام لحساب معدل تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: رسم تخطيطي لتمدد الخلايا القاتلة الطبيعية من عينات الأعضاء البشرية الصلبة. باختصار ، يتم تقطيع عينات الكبد البشري التي تم الحصول عليها إلى مكعبات صغيرة للهضم الميكانيكي. ثم يتم عزل الخلايا المنفصلة باستخدام السيليكا المطلية ب PVP ووسائط فصل الخلايا الليمفاوية. علاوة على ذلك ، يتم توسيع خلايا NK باستخدام بروتوكول التوسيع الموضح في الشكل 2.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 آبار لوحة G-REX ويلسون وولف 80240 م لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية AF647 المترافق AffiniPure F (ab') 2 جزء الماعز المضاد للإنسان IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 109-606-088 لقياس التدفق الخلوي كولاجيناز الرابع سيغما C4-22-1G لعزل TILs وسائط التبريد كورنينج 35-010-السيرة الذاتية 90٪ المكونات: مصل الأبقار الجنينية (FBS) وسائط التبريد سيغما د2050 10٪ المكونات: ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) gentleMACS C الأنابيب ميلتيني بيوتيك 130-093-237 لعزل TILs gentleMACS أوكتو ميلتيني بيوتيك استشهد لعزل TILs محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS - بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم) ثيرموفيشر 14170120 لعزل TILs IL-15 البشري بيبروتك 200-15 لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية IL-2 البشري بيبروتك 200-02 لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية خلايا التغذية المشعة 221 mIL21 تم إنشاؤه في مختبر الدكتور دونغفانغ ليو مجمدة في وسائط الحفظ بالتبريد وسائط فصل الخلايا الليمفاوية كورنينج 25-072-السيرة الذاتية لعزل TILs استنساخ CD3 المضاد للإنسان PE HIT3a بيوليجند 300308 لقياس التدفق الخلوي استنساخ PE / Cy7 CD56 (NCAM) المضاد للإنسان 5.1H11 بيو ليجند 362509 لقياس التدفق الخلوي بيركول جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17089101 لعزل TILs خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) مركز نيويورك للدم معزولة عن بلازما المتبرعين الأصحاء ، مجمدة في وسائط الحفظ بالتبريد وسائط R-10 VWR 45000-404 المكونات: RPMI 1640 وسائط R-10 VWR 45000-304 1٪ المكونات: L-glutamine وسائط R-10 VWR 45000-652 1٪ المكونات: البنسلين ستربتومايسين وسائط R-10 كورنينج 35-010-السيرة الذاتية 10٪ المكونات: مصل الأبقار الجنينية (FBS) تريبان بلو كورنينج 25-900-سنتيلتر لعد الخلايا